Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Pobieranie szpiku kostnego
- W asepcie usuń kość udową i piszczel myszy i oczyść kości za pomocą sterylnych narzędzi. Oczyszczone kości umieścić w Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + 5 mM kwasu N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etanosulfonowego (HEPES) + 0,2 mg/ml L-glutaminy + 0,05 mM 2-merkaptoetanolu + 50 mg/ml siarczanu gentamycyny + 10 000 U/ml penicyliny/streptomycyny + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS, DMEM-10 kompletne) i inkubować probówkę na lodzie przez 15 minut.
- Usuń proksymalne i dystalne przeguby kulowe za pomocą nożyczek. Wprowadzić igłę o sile 25 g dołączoną do strzykawki o pojemności 10 ml wypełnionej pożywką do zagłębienia kości. Wypłukać szpik kostny za pomocą DMEM-10 complete. Ponownie zawiesić wszelkie grudki, delikatnie pipetując pożywkę w górę i w dół.
- Odwirować komórki przez 10 minut przy 300 x g i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru. W tym momencie albo zamroź komórki za pomocą 90% FBS + 10% dimetylosulfotlenku (DMSO), albo umieść komórki na 15-centymetrowej szalce Petriego, aby rozróżnić makrofagi przy użyciu pożywki kondycjonowanej L929 (krok 2.1).
2. Różnicowanie makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego
- Używając wstępnie podgrzanej pożywki różnicującej (21 ml kompletnej pożywki DMEM-10 i 9 ml pożywki kondycjonowanej komórkami L929, jak opisano przez Swansona i wsp.), umieść komórki szpiku kostnego na 15-centymetrowej szalce Petriego bez hodowli tkankowej (1,2-1,5 x 107 komórek). Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla lub CO2 przez 7 dni. Dodać dodatkowe 30 ml pożywki różnicującej do płytki w dniu 3 lub 4.
nuta: Ważne jest, aby nie używać płytek poddanych działaniu kultur tkankowych, ponieważ makrofagi będą trudne do oderwania i pobrania.
- Aby zebrać makrofagi, przemyj płytkę solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i dodaj 20 ml zimnego PBS + 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Inkubować płytkę w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Zebrać komórki, pipetując PBS + EDTA na komórki i przemywając płytkę 10 ml PBS. Połącz oba mycia w dwóch stożkowych probówkach o pojemności 15 ml.
- Odwirować komórki przy 300 x g przez 10 minut i ponownie zawiesić komórki w 10 ml DMEM wolnego od czerwieni fenolowej + 5 mM HEPES + 0,2 mg / ml L-glutaminy + 0,05 mM 2-merkaptoetanolu + 5% FBS (DMEM-5) i policzyć komórki za pomocą hemocytometru lub licznika Coredler. Utrzymuj komórki na lodzie podczas liczenia.
- Wysiewaj makrofagi na płytkach pokrytych kulturami tkankowymi w temperaturze 2 x 105 komórek/ml. Do eksperymentów mikroskopowych wysiewa się 1 ml komórek na szkiełkach nakrywkowych w 24-dołkowych płytkach. W przypadku testów uwalniania dehydrogenazy mleczanowej (LDH) należy zasiać 100 μl komórek na 96-dołkowej płytce. W przypadku testu LDH należy wysiać 9 dołków (3 dołki niepoddane obróbce, 3 dołki ze 100% kontrolą lizy i 3 dołki dla bodźca eksperymentalnego).
- Wirować 96-dołkową płytkę przez 5 minut przy 300 x g, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozmieszczone w studzience.
- Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C + 5% CO2 przed rozpoczęciem procesu zalewania.
3. Gruntowanie
- Zastąp pożywkę świeżą pożywką (DMEM-5) zawierającą 100 ng/ml lipopolisacharydu lub LPS (500 μl dla płytki 24-dołkowej lub 50 μl dla płytki 96-dołkowej).
nuta: Istnieje wiele zmian strukturalnych w LPS, które wpływają na zdolność do stymulowania gruntowania za pośrednictwem TLR4. LPS firmy Salmonella minnesota R595 (Re) jest dostępny u wielu dostawców i jest zalecany.
- Inkubować płytkę przez 3 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
4. Aktywacja inflamasomu NLRP3 za pomocą nigerycyny i znakowanie za pomocą FAM-YVAD-FMK
- Usuń pożywkę i zastąp ją 290 μl DMEM-5 zawierającego 5 μM nigerycyny i 5 mM glicyny. Glicyna jest dodawana w celu zmniejszenia ilości lizy komórek, która zachodzi podczas aktywacji kaspazy-1. Inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Używaj zarówno makrofagów typu dzikiego, jak i z niedoborem kaspazy-1, aby upewnić się, że obserwowane oznakowanie jest specyficzne dla kaspazy-1.
- W ciągu ostatnich 45 minut dodaj 10 μL 30x FAM-YVAD-FMK, przygotowanego zgodnie z zaleceniami producenta.
- Po 60 minutach usuń pożywkę i umyj komórki trzy razy po 5 minut każdy 1 ml zimnego PBS.
- Do każdej studzienki dodać 250 μl 2% paraformaldehydu i inkubować na lodzie pokrytym folią aluminiową przez 30 minut.
- W ciągu ostatnich 5 minut dodaj 4 μl 0,2 mM fluorescencyjnego barwnika kwasem nukleinowym o gęstości 0,2 mM w celu oznaczenia jąder. 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) lub inne barwniki mogą być również używane do znakowania DNA.
- Umyj komórki trzykrotnie 1 ml zimnego PBS i zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych za pomocą 7 μl środka mocującego zapobiegającego blaknięciu. Poczekaj, aż podłoże montażowe stwardnieje przez noc przed uszczelnieniem szkiełka nakrywkowego do szkiełka mikroskopowego za pomocą lakieru do paznokci.
- Zobrazuj makrofagi za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ex/Em dla FAM-YVAD-FMK to 492/520nm i 642/661 dla barwienia kwasami nukleinowymi dalekiej czerwieni fluorescencyjnej. Upewnij się, że mikroskop jest ustawiony w taki sposób, aby nieleczone komórki nie wykazywały żadnych zabarwień tła w kanale 488. W przeciwnym razie zostanie wykryte barwienie FAM-YVAD-FMK w tle, a nie rzeczywista aktywna kaspaza-1.
5. Obrazowanie znakowanych makrofagów za pomocą mikroskopii konfokalnej
UWAGA: Poplamione komórki można oglądać po tym, jak szkiełka nakrywkowe pozostawiono do utwardzenia przez noc i uszczelniono je lakierem do paznokci na szkiełku mikroskopowym. Tutaj opisano obrazowanie przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Komórki można również oglądać za pomocą standardowej mikroskopii fluorescencyjnej.
- Umieść szkiełko z nieleczonymi komórkami kontrolnymi na stoliku mikroskopu i skoncentruj mikroskop na komórkach.
- Korzystając z ustawień tabeli przeglądowej mikroskopu (LUT), dostosuj przesunięcie tak, aby w nieleczonych komórkach nie było dodatniego barwienia FAM-YVAD-FMK. Proces ten można również przeprowadzić przy użyciu makrofagów z niedoborem kaspazy-1.
nuta: Przesunięcie musi być dostosowane dla każdego kanału użytego w eksperymencie, ale ustawienie prawidłowego przesunięcia jest najbardziej krytyczne dla kanału FAM-YVAD-FMK i kanałów przeciwciał fluorescencyjnych. Przesunięcie kanału DNA jest mniej krytyczne. Po ustawieniu przesunięcia nie dostosowuj tego ustawienia do końca eksperymentu.
- Przesunąć szkiełko na próbkę poddaną działaniu nigerycyny. Znajdź pole, które zawiera zarówno komórki, które są dodatnie, jak i ujemne dla barwienia FAM-YVAD-FMK. Dostosuj płaszczyznę obrazowania kanału FAM-YVAD-FMK do płaszczyzny o największej intensywności barwienia dodatniego. Zwykle będzie to płaszczyzna, w której obrazowany jest środek ogniska inflamasomu.
- Dostosuj wzmocnienie tak, aby ogniska były widoczne w komórkach, które mają skondensowane jądra. Po ustawieniu zarówno wzmocnienia, jak i przesunięcia, pozostaw te ustawienia do końca sesji obrazowania.
nuta: Jednym z łatwych sposobów określenia, czy komórka jest piroptotyczna, jest przyjrzenie się morfologii jądrowej. Komórki z aktywną kaspazą-1 mają zaokrąglone i skondensowane jądra, podczas gdy jąderka są widoczne w komórkach bez aktywacji kaspazy-1, a morfologia jądra jest podobna do morfologii komórek nieleczonych.
- Zbierz obrazy 5 losowo wybranych pól w 100-krotnym powiększeniu całkowitym. Zwykle daje to około 40 komórek na obraz. Powtórz ten proces dla każdej próbki.
- Policz liczbę komórek na każdym obrazie za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Następnie policz liczbę komórek, które mają dodatnie barwienie FAM-YVAD-FMK. Reprezentują poziom aktywacji kaspazy-1 jako procent komórek dodatnich FAM-YVAD-FMK.
