Wykrywanie aktywacji inflamasomu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Pobieranie szpiku kostnego

1. W asepcie usuń kość udową i piszczel myszy i oczyść kości za pomocą sterylnych narzędzi. Oczyszczone kości umieścić w Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + 5 mM kwasu N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etanosulfonowego (HEPES) + 0,2 mg/ml L-glutaminy + 0,05 mM 2-merkaptoetanolu + 50 mg/ml siarczanu gentamycyny + 10 000 U/ml penicyliny/streptomycyny + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS, DMEM-10 kompletne) i inkubować probówkę na lodzie przez 15 minut.
2. Usuń proksymalne i dystalne przeguby kulowe za pomocą nożyczek. Wprowadzić igłę o sile 25 g dołączoną do strzykawki o pojemności 10 ml wypełnionej pożywką do zagłębienia kości. Wypłukać szpik kostny za pomocą DMEM-10 complete. Ponownie zawiesić wszelkie grudki, delikatnie pipetując pożywkę w górę i w dół.
3. Odwirować komórki przez 10 minut przy 300 x g i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru. W tym momencie albo zamroź komórki za pomocą 90% FBS + 10% dimetylosulfotlenku (DMSO), albo umieść komórki na 15-centymetrowej szalce Petriego, aby rozróżnić makrofagi przy użyciu pożywki kondycjonowanej L929 (krok 2.1).

2. Różnicowanie makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

1. Używając wstępnie podgrzanej pożywki różnicującej (21 ml kompletnej pożywki DMEM-10 i 9 ml pożywki kondycjonowanej komórkami L929, jak opisano przez Swansona i wsp.), umieść komórki szpiku kostnego na 15-centymetrowej szalce Petriego bez hodowli tkankowej (1,2-1,5 x 10⁷ komórek). Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla lub CO₂ przez 7 dni. Dodać dodatkowe 30 ml pożywki różnicującej do płytki w dniu 3 lub 4.
   nuta: Ważne jest, aby nie używać płytek poddanych działaniu kultur tkankowych, ponieważ makrofagi będą trudne do oderwania i pobrania.
2. Aby zebrać makrofagi, przemyj płytkę solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i dodaj 20 ml zimnego PBS + 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Inkubować płytkę w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Zebrać komórki, pipetując PBS + EDTA na komórki i przemywając płytkę 10 ml PBS. Połącz oba mycia w dwóch stożkowych probówkach o pojemności 15 ml.
3. Odwirować komórki przy 300 x g przez 10 minut i ponownie zawiesić komórki w 10 ml DMEM wolnego od czerwieni fenolowej + 5 mM HEPES + 0,2 mg / ml L-glutaminy + 0,05 mM 2-merkaptoetanolu + 5% FBS (DMEM-5) i policzyć komórki za pomocą hemocytometru lub licznika Coredler. Utrzymuj komórki na lodzie podczas liczenia.
4. Wysiewaj makrofagi na płytkach pokrytych kulturami tkankowymi w temperaturze 2 x 10⁵ komórek/ml. Do eksperymentów mikroskopowych wysiewa się 1 ml komórek na szkiełkach nakrywkowych w 24-dołkowych płytkach. W przypadku testów uwalniania dehydrogenazy mleczanowej (LDH) należy zasiać 100 μl komórek na 96-dołkowej płytce. W przypadku testu LDH należy wysiać 9 dołków (3 dołki niepoddane obróbce, 3 dołki ze 100% kontrolą lizy i 3 dołki dla bodźca eksperymentalnego).
5. Wirować 96-dołkową płytkę przez 5 minut przy 300 x g, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozmieszczone w studzience.
6. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C + 5% CO₂ przed rozpoczęciem procesu zalewania.

3. Gruntowanie

1. Zastąp pożywkę świeżą pożywką (DMEM-5) zawierającą 100 ng/ml lipopolisacharydu lub LPS (500 μl dla płytki 24-dołkowej lub 50 μl dla płytki 96-dołkowej).
   nuta: Istnieje wiele zmian strukturalnych w LPS, które wpływają na zdolność do stymulowania gruntowania za pośrednictwem TLR4. LPS firmy Salmonella minnesota R595 (Re) jest dostępny u wielu dostawców i jest zalecany.
2. Inkubować płytkę przez 3 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .

4. Aktywacja inflamasomu NLRP3 za pomocą nigerycyny i znakowanie za pomocą FAM-YVAD-FMK

1. Usuń pożywkę i zastąp ją 290 μl DMEM-5 zawierającego 5 μM nigerycyny i 5 mM glicyny. Glicyna jest dodawana w celu zmniejszenia ilości lizy komórek, która zachodzi podczas aktywacji kaspazy-1. Inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Używaj zarówno makrofagów typu dzikiego, jak i z niedoborem kaspazy-1, aby upewnić się, że obserwowane oznakowanie jest specyficzne dla kaspazy-1.
2. W ciągu ostatnich 45 minut dodaj 10 μL 30x FAM-YVAD-FMK, przygotowanego zgodnie z zaleceniami producenta.
3. Po 60 minutach usuń pożywkę i umyj komórki trzy razy po 5 minut każdy 1 ml zimnego PBS.
4. Do każdej studzienki dodać 250 μl 2% paraformaldehydu i inkubować na lodzie pokrytym folią aluminiową przez 30 minut.
5. W ciągu ostatnich 5 minut dodaj 4 μl 0,2 mM fluorescencyjnego barwnika kwasem nukleinowym o gęstości 0,2 mM w celu oznaczenia jąder. 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) lub inne barwniki mogą być również używane do znakowania DNA.
6. Umyj komórki trzykrotnie 1 ml zimnego PBS i zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych za pomocą 7 μl środka mocującego zapobiegającego blaknięciu. Poczekaj, aż podłoże montażowe stwardnieje przez noc przed uszczelnieniem szkiełka nakrywkowego do szkiełka mikroskopowego za pomocą lakieru do paznokci.
7. Zobrazuj makrofagi za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ex/Em dla FAM-YVAD-FMK to 492/520nm i 642/661 dla barwienia kwasami nukleinowymi dalekiej czerwieni fluorescencyjnej. Upewnij się, że mikroskop jest ustawiony w taki sposób, aby nieleczone komórki nie wykazywały żadnych zabarwień tła w kanale 488. W przeciwnym razie zostanie wykryte barwienie FAM-YVAD-FMK w tle, a nie rzeczywista aktywna kaspaza-1.

5. Obrazowanie znakowanych makrofagów za pomocą mikroskopii konfokalnej

UWAGA: Poplamione komórki można oglądać po tym, jak szkiełka nakrywkowe pozostawiono do utwardzenia przez noc i uszczelniono je lakierem do paznokci na szkiełku mikroskopowym. Tutaj opisano obrazowanie przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Komórki można również oglądać za pomocą standardowej mikroskopii fluorescencyjnej.

1. Umieść szkiełko z nieleczonymi komórkami kontrolnymi na stoliku mikroskopu i skoncentruj mikroskop na komórkach.
2. Korzystając z ustawień tabeli przeglądowej mikroskopu (LUT), dostosuj przesunięcie tak, aby w nieleczonych komórkach nie było dodatniego barwienia FAM-YVAD-FMK. Proces ten można również przeprowadzić przy użyciu makrofagów z niedoborem kaspazy-1.
   nuta: Przesunięcie musi być dostosowane dla każdego kanału użytego w eksperymencie, ale ustawienie prawidłowego przesunięcia jest najbardziej krytyczne dla kanału FAM-YVAD-FMK i kanałów przeciwciał fluorescencyjnych. Przesunięcie kanału DNA jest mniej krytyczne. Po ustawieniu przesunięcia nie dostosowuj tego ustawienia do końca eksperymentu.
3. Przesunąć szkiełko na próbkę poddaną działaniu nigerycyny. Znajdź pole, które zawiera zarówno komórki, które są dodatnie, jak i ujemne dla barwienia FAM-YVAD-FMK. Dostosuj płaszczyznę obrazowania kanału FAM-YVAD-FMK do płaszczyzny o największej intensywności barwienia dodatniego. Zwykle będzie to płaszczyzna, w której obrazowany jest środek ogniska inflamasomu.
4. Dostosuj wzmocnienie tak, aby ogniska były widoczne w komórkach, które mają skondensowane jądra. Po ustawieniu zarówno wzmocnienia, jak i przesunięcia, pozostaw te ustawienia do końca sesji obrazowania.
   nuta: Jednym z łatwych sposobów określenia, czy komórka jest piroptotyczna, jest przyjrzenie się morfologii jądrowej. Komórki z aktywną kaspazą-1 mają zaokrąglone i skondensowane jądra, podczas gdy jąderka są widoczne w komórkach bez aktywacji kaspazy-1, a morfologia jądra jest podobna do morfologii komórek nieleczonych.
5. Zbierz obrazy 5 losowo wybranych pól w 100-krotnym powiększeniu całkowitym. Zwykle daje to około 40 komórek na obraz. Powtórz ten proces dla każdej próbki.
6. Policz liczbę komórek na każdym obrazie za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Następnie policz liczbę komórek, które mają dodatnie barwienie FAM-YVAD-FMK. Reprezentują poziom aktywacji kaspazy-1 jako procent komórek dodatnich FAM-YVAD-FMK.