$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Różnicowanie makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego
- Używając wstępnie podgrzanej pożywki różnicującej (21 ml kompletnej pożywki DMEM-10 i 9 ml pożywki kondycjonowanej komórkami L929, jak opisano przez Swansona i wsp.), umieść komórki szpiku kostnego na 15-centymetrowej szalce Petriego bez hodowli tkankowej (1,2-1,5 x 107 komórek). Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 7 dni. Dodać dodatkowe 30 ml pożywki różnicującej do płytki w dniu 3 lub 4,
nuta: Ważne jest, aby nie używać płytek poddanych działaniu kultur tkankowych, ponieważ makrofagi będą trudne do oderwania i pobrania.
- Aby zebrać makrofagi, przemyj płytkę solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i dodaj 20 ml zimnego PBS + 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Inkubować płytkę w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Zebrać komórki, pipetując PBS + EDTA na komórki i przemywając płytkę 10 ml PBS. Połącz oba mycia w dwóch stożkowych probówkach o pojemności 15 ml.
- Odwirować komórki przy 300 x g przez 10 minut i ponownie zawiesić komórki w 10 ml DMEM wolnego od czerwieni fenolowej + 5 mM HEPES + 0,2 mg / ml L-glutaminy + 0,05 mM 2-merkaptoetanolu + 5% FBS (DMEM-5) i policzyć komórki za pomocą hemocytometru lub licznika Coredler. Utrzymuj komórki na lodzie podczas liczenia.
- Wysiewaj makrofagi na płytkach pokrytych kulturami tkankowymi w temperaturze 2 x 105 komórek/ml. Do eksperymentów mikroskopowych wysiewa się 1 ml komórek na szkiełkach nakrywkowych w 24-dołkowych płytkach. W przypadku testów uwalniania LDH wysiewaj 100 μl komórek na 96-dołkowej płytce. W przypadku testu LDH należy wysiać 9 dołków (3 dołki niepoddane obróbce, 3 dołki ze 100% kontrolą lizy i 3 dołki dla bodźca eksperymentalnego).
- Wirować 96-dołkową płytkę przez 5 minut przy 300 x g, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozmieszczone w studzience.
- Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C + 5% CO2 przed rozpoczęciem procesu zalewania.
2. Gruntowanie
- Zastąp pożywkę świeżą pożywką (DMEM-5) zawierającą 100 ng/ml LPS (500 μl dla płytki 24-dołkowej lub 50 μl dla płytki 96-dołkowej).
nuta: Istnieje wiele zmian strukturalnych w LPS, które wpływają na zdolność do stymulowania gruntowania za pośrednictwem TLR4. LPS firmy Salmonella minnesota R595 (Re) jest dostępny u wielu dostawców i jest zalecany.
- Inkubować płytkę przez 3 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
3. Aktywacja inflamasomu NLRP3 za pomocą nigerycyny
- Usuń pożywkę i zastąp ją 290 μl DMEM-5 zawierającego 5 μM nigerycyny i 5 mM glicyny. Glicyna jest dodawana w celu zmniejszenia ilości lizy komórek, która zachodzi podczas aktywacji kaspazy-1. Inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Używaj zarówno makrofagów typu dzikiego, jak i z niedoborem kaspazy-1, aby upewnić się, że obserwowane oznakowanie jest specyficzne dla kaspazy-1.
- Po 60 minutach usuń pożywkę i umyj komórki trzy razy po 5 minut każdy 1 ml zimnego PBS.
4. Barwienie przeciwciał
UWAGA: Aby oznaczyć komórki przeciwciałami do wykrywania ASC, wysiewamy, zaszczepiamy i wystawiamy komórki na działanie nigerycyny identycznie jak w poprzedniej sekcji. Późniejsze przetwarzanie przebiega w następujący sposób:
- Umyj komórki trzy razy przez 5 minut każde 1 ml zimnego PBS. Dodać 250 μl roztworu utrwalającego i przepuszczalnego. Inkubować komórki na lodzie i przykrywać przez 30 minut.
- Przemyj makrofagi trzy razy przez 5 minut każdy 1 ml buforu do mycia.
- Dodać 250 μl pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko ASC rozcieńczonego w stosunku 1:500 do buforu do przemywania i inkubować przez 1 godzinę na lodzie. Dołącz jedno szkiełko nakrywkowe, które nie otrzyma żadnego przeciwciała pierwszorzędowego, ale otrzyma tylko przeciwciało wtórne. Szkiełko nakrywkowe będzie używane podczas ustawiania mikroskopu w celu ustawienia prawidłowego przesunięcia.
- Przemyć komórki trzy razy przez 5 minut każda, za pomocą 1 ml buforu do płukania.
- Dodać 250 μl przeciwciała drugorzędowego (barwnik fluorescencyjny, sprzężony z kozią anty-myszą) rozcieńczonego w stosunku 1:500 w buforze do przemywania i inkubować przez 1 godzinę na lodzie. Dodać 4 μl 0,2 mM barwienia kwasem nukleinowym dalekiej czerwieni fluorescencyjnej przez ostatnie 5 minut tej inkubacji, aby znakować jądra.
- Przemyj komórki 3x 1 ml buforu do płukania na zimno i zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych za pomocą 7 μl środka mocującego zapobiegającego blaknięciu. Poczekaj, aż podłoże mocujące stwardnieje przez noc, a następnie przyklej szkiełko nakrywkowe do szkiełka mikroskopowego za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci.
- Obrazowanie makrofagów za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ex/Em dla przeciwciała drugorzędowego wynosi 555/580 nm i 642/661 dla barwienia fluorescencyjnego kwasu nukleinowego w kolorze dalekiej czerwieni.