Test uwalniania dehydrogenazy mleczanowej w celu wykrycia śmierci makrofagów po ekspozycji na nigerycynę

Streszczenie

Źródło: den Hartigh, A.B. et al., Wykrywanie aktywacji inflamasomu i śmierci komórek piroptotycznych w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film demonstruje test dehydrogenazy mleczanowej do wykrywania śmierci makrofagów za pośrednictwem inflamasomów. Makrofagi są poddawane działaniu lipopolisacharydu w celu pobudzenia, a następnie ekspozycji na nigerycynę w celu spowodowania śmierci komórek wywołanej inflamasomem, która jest określana przez test dehydrogenazy mleczanowej.

Protokół

1. Test uwalniania LDH

UWAGA: Aby przeprowadzić test uwalniania LDH, umieść komórki na 96-dołkowej płytce. Nie usuwaj podłoża po zagruntowaniu.

1. Zastąp pożywkę świeżą pożywką (DMEM-5: 10 ml DMEM wolnego od czerwieni fenolowej + 5 mM HEPES + 0,2 mg/ml L-glutaminy + 0,05 mM 2-merkaptoetanolu + 5% FBS) zawierającą 100 ng/ml LPS w studzienkach zawierających przylegające komórki makrofagów (500 μl dla płytek 24-dołkowych lub 50 μL dla płytek 96-dołkowych).
   nuta: Istnieje wiele zmian strukturalnych w LPS, które wpływają na zdolność do stymulowania gruntowania za pośrednictwem TLR4. Zalecany jest LPS z Salmonella minnesota R595 (Re).
2. Inkubować płytkę przez 3 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
3. Dodać 50 μl DMEM-5 zawierającego 10 μM nigerycyny do dołków doświadczalnych i 50 μL DMEM-5 do dołków do spontanicznej i 100% kontrolnej lizy. Inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
4. Po 30 minutach dodać 10 μl 10-krotnego buforu do lizy do 100% dołków kontrolnych lizy i dodać 10 μl DMEM-5 do pozostałych studzienek. Podczas tej inkubacji wyjmij 1 fiolkę mieszanki substratów (1,5 ml liofilizowanego substratu) i 1 podwielokrotność buforu do oznaczania (~12 ml) z zamrażarki i pozwól im rozmrozić się przed światłem do temperatury pokojowej.
   nuta: Mieszanina substratów zawiera sól tetrazolową (fiolet jodonitrotetrazoliowy), która jest przekształcana w czerwony produkt formazanu.
5. Po 60 minutach całkowitej inkubacji odwirować płytkę przez 5 minut przy 500 x g w temperaturze 10 °C. Przenieść 50 μl supernatantu na przezroczystą płytkę z płaskim dnem. W tym czasie dodać 12 ml buforu do testu do fiolki z mieszanką substratów i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut przed użyciem.
6. Dodaj 50 μl substratu do każdej studzienki i inkubuj przez 30 minut w ciemności. Uwzględnij dołki tylko średnie dla wartości pustych. Sprawdź tabliczkę po 15 minutach, aby upewnić się, że sygnał nie przekroczy granicy wykrywalności czytnika tabliczek.
7. Po 30 minutach dodać 50 μl roztworu zatrzymującego (1 M kwas octowy) i zmierzyć OD₄₉₀ za pomocą czytnika płytek.
8. Oblicz procent lizy komórek, korzystając z następującego wzoru:
   % cytotoksyczności = ((Eksperymentalny - Spontaniczny)/(Maksymalny - Spontaniczny))×100
   Eksperymentalny: komórki leczone nigerycyną; spontaniczne: nieleczone komórki; Maksimum: Komórki wystawione na działanie buforu do lizy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Cytotox96 Test cytotoksyczności nieradioaktywnej	Fisher Naukowy	PR-G1780	Obejmuje mieszaninę substratów i bufor do oznaczania; Zastrzeżone preparaty. Roztwór zatrzymujący to 1 M kwas octowy
DMEM, wysoki poziom glukozy, bez glutaminy, bez czerwieni fenolowej	Invitrogen	31053028
PBS firmy Dulbecco, bez wapnia, bez magnezu	Invitrogen	14190144
Surowica bydlęca płodu, kwalifikowana, pochodzenie amerykańskie	Invitrogen	26140079	Inaktywacja termiczna w temperaturze 55°C przez 50 min
Gentamycyna	Invitrogen	15750060
Ultraczysty LPS z Salmonella minnesota R595 (Re)	Wykaz produktów biologicznych	Z numerem 434
Czytnik płytek Spectramax M3	Urządzenia molekularne	5000414
L-glutamina	Invitrogen	21051024