Indukcja i wizualizacja zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili we wstępnie znakowanych neutrofilach

Streszczenie

Źródło: Arends, E. J. et al., Wysokoprzepustowy test do oceny i ilościowego określania tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili.J. Vis. Exp.(2019 rok)

Ten film demonstruje indukcję i wizualizację zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili lub NET w wstępnie oznakowanych neutrofilach przy użyciu surowicy pacjenta zawierającej przeciwciała cytoplazmatyczne anty-neutrofilowe. Co więcej, zastosowanie nieprzepuszczalnego barwnika DNA i mikroskopii fluorescencyjnej umożliwia wizualizację NET.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.

1. Izolacja zdrowych neutrofili

1. Pobrać 20 ml krwi obwodowej od zdrowego dawcy w dwóch probówkach pokrytych kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) o pojemności 10 ml.
2. Umieść 10 ml krwi w sterylnej probówce o pojemności 50 ml i dodaj sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do 32,5 ml.
3. Dodaj gradient gęstości (np. Ficoll-amidotrizoaat) pod komórkami.
   1. Pobrać 14 ml gradientu gęstości za pomocą pipety 10 ml i kontrolera pipety.
   2. Umieścić pipetę na dnie probówki o pojemności 50 ml.
   3. Zdjąć kontroler pipety z pipety, pozwalając, aby gradient gęstości wypłynął z pipety grawitacyjnie, aż do osiągnięcia maksimum przez efekt kapilarny (pozostanie 1-2 ml), bez użycia silnika.
   4. Wyjmij pipetę, kładąc kciuk na jej wierzchu, zapobiegając w ten sposób wyciekaniu gradientu gęstości podczas wyjmowania pipety.
4. Wiruj rurki przez 20 minut przy 912 x g i temperaturze pokojowej (RT) bez przyspieszania i hamowania.
   UWAGA: Czerwone krwinki (RBC) i neutrofile mają dużą gęstość i znajdują się na dnie probówki o pojemności 50 ml. Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) są oddzielone i znajdują się na szczycie gradientu gęstości jako biały pierścień. Osocze rozcieńczone PBS będzie znajdować się powyżej PBMC. W razie potrzeby PBMC można wyizolować, przenosząc biały pierścień do nowej probówki o pojemności 50 ml z dodatkowymi etapami przemywania solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
5. Ostrożnie usuń najpierw biały pierścień zawierający PBMC, następnie usuń osocze rozcieńczone PBS, a na końcu warstwę gradientu gęstości tak bardzo, jak to możliwe.
6. Aby wyizolować neutrofile z mieszaniny neutrofili/erytrocytów, należy lizować erytrocyty zimną sterylną wodą destylowaną.
   1. Weź z lodówki zimną sterylną butelkę na wodę destylowaną i 10x skoncentrowaną kolbę PBS.
   2. Pracuj szybko nad tym krokiem. Dodaj 36 ml zimnej, sterylnej wody destylowanej bezpośrednio na wierzch granulki i dokładnie wymieszaj. Dodaj 4 ml 10x PBS po 20 s, aby uzyskać roztwór izotoniczny. Dokładnie wymieszaj raz.
   3. Wirować rurkę przez 5 minut przy 739 x g i 4 °C (w celu usunięcia erytrocytów). Neutrofile będą znajdować się w białym granule.
   4. Ostrożnie wyrzucić supernatant. Wykonaj ponownie krok 1.6.2 i upewnij się, że pellet jest prawidłowo zawieszony.
   5. Wirować rurkę przez 5 minut w temperaturze 328 x g i 4 °C.
   6. Ostrożnie usunąć sklarowany osad i ponownie zawiesić osad w 5 ml PBS. Policz neutrofile i trzymaj je na lodzie.
      UWAGA: Oczekiwana wydajność z 1 probówki krwi (10 ml) wynosi około 15-75 milionów neutrofili.

2. Znakowanie neutrofili czerwoną fluorescencyjną komórką

1. Wykonać zawiesinę neutrofili 10-20 milionów neutrofili w 2 ml PBS w probówce o pojemności 15 ml.
2. Przygotować roztwór 2 ml PBS z 4 μl łącznika komórek czerwonej fluorescencji 2 μM (patrz tabela materiałów) w innej probówce o pojemności 15 ml. Dodaj go delikatnie do zawiesiny neutrofili i dokładnie wymieszaj.
3. Inkubować w ciemności dokładnie przez 25 minut w temperaturze 37 °C, aby oznaczyć neutrofile łącznikiem komórek czerwonej fluorescencji.
4. Dezaktywować etykietę, dodając pożywkę Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 zawierającą 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w temperaturze pokojowej do 15 ml i dokładnie wymieszać. Upewnij się, że osad jest ostrożnie ponownie zawieszony, jeśli uformował się pellet.
5. Wiruj rurkę przez 5 minut przy 328 x g i RT.
6. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml pożywki RPMI 1640 wolnej od czerwieni fenolowej zawierającej 2% FBS i 10% penicyliny/streptomycyny (P/S) w temperaturze pokojowej. Policz neutrofile.
   nuta: Po znakowaniu komórek metodą czerwonej fluorescencji może dojść do utraty komórek o 50%.

3. Indukcja tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili

1. Wykonać zawiesinę komórek 0,42 x 10⁶ komórek/ml w pożywce RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej zawierającej 2% FBS i 10% P/S.
2. Dodaj 37 500 neutrofili w 90 μl na studzienkę w czarnej 96-dołkowej płytce z płaskim dnem.
3. Dodać 10 μl wybranego bodźca (np. surowicy pacjenta) w trzech egzemplarzach, aby osiągnąć stężenie 10% w studzience. Należy zawsze dołączyć kontrolę ujemną (pożywkę) w trzech egzemplarzach.
4. Inkubować w ciemności w temperaturze 37 °C przez żądany czas, od 30 minut do 2, 4 lub 6 godzin. Zaleca się inkubację przez 4 godziny.
5. Obliczyć objętość potrzebną do dodania 25 μl 5 μM nieprzepuszczalnego barwnika DNA (patrz tabela materiałów), aby osiągnąć końcowe stężenie 1 μM w studzience. W razie potrzeby rozcieńczyć wstępnie w pożywce RPMI 1640 zawierającej 2% FBS i 10% P/S, aby uzyskać stężenie 5 μM.
6. Dodać 25 μl 5 μM nieprzepuszczalnego barwnika DNA na 15 minut przed końcem czasu inkubacji. Kontynuować inkubację przez kolejne 15 minut w temperaturze 37 °C w ciemności.
7. Usunąć supernatant (~125 μL) bardzo ostrożnie i przechowywać go w razie potrzeby. Dodać 100 μl 4% paraformaldehydu (PFA). Trzymaj się w ciemności i natychmiast przejdź do kroku 4.

4. Wizualizacja zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET) za pomocą mikroskopii konfokalnej 3D o wysokiej zawartości i wysokiej rozdzielczości

1. Skonfiguruj ustawienia w immunofluorescencyjnym mikroskopie konfokalnym, klikając Ustawienia akwizycji.
   1. Kliknij kartę Konfiguruj.
   2. Wybierz obiektyw i kamerę. Wybierz obiektyw 10X Apo Lambda z trybem akwizycji konfokalnego otworka 60 μm.
   3. Kliknij na Talerz i wybierz 96-dołkową plastikową płytkę. Wybierz witryny, które chcesz odwiedzić, i wybierz ustaloną liczbę witryn. Wypełnij 3 kolumny i 3 rzędy bez zachodzenia na siebie (0 μm), które pokrywają łącznie 45% studni.
   4. Kliknij Przejęcie. Wybierz opcję Włącz ustawianie ostrości na podstawie lasera. W razie potrzeby wybierz opcję Uzyskaj serię Z/szereg czasowy.
   5. Kliknij Autofokus witryny.
      1. Kliknij Focus on Plate Bottom (Ostrość na dnie) | Offset by Bottom Thickness (Przesunięcie o grubość dna). Aby początkowa studnia znalazła próbkę, wybierz pierwszą zdobytą studnię. Dla autofokusa witryny wybierz wszystkie witryny.
   6. Kliknij Długości fal.
      1. Jako liczbę długości fal wybierz 2. Jako poziom zagęszczenia korekcji cieniowania TL wybierz 2.
      2. W polu Wavelength 1 (Długość fali 1) wybierz opcję Texas Red.
         1. Jako opcje autofokusa wybierz laser z przesunięciem Z, po przesunięciu lasera 1,1 μm. Użyj stosu Z z niestandardowym zakresem 200-10.
      3. Dla długości fali 2 wybierz izotiocyjanian fluoresceiny (FITC).
         1. Jako opcje autofokusa wybierz laser z przesunięciem Z od w1 0 μm. Użyj stosu Z z niestandardowym zakresem 200-10.
         2. Jako opcje akwizycji wybierz Seria Z i maksimum obrazu projekcji 2D. Jako opcje akwizycji wybierz opcję Korekcja cieniowania | Wył.
   7. Wybierz opcję Z Series (Seria Z). Wybierz liczbę kroków: 10. Wybierz rozmiar kroku: 3 μm (całkowity zakres wyniesie 27 μm).
2. Umieść płytkę w immunofluorescencyjnym mikroskopie konfokalnym.
   1. Kliknij kartę Uruchom.
      1. Wypełnij nazwę i opis tablicy rejestracyjnej i wybierz miejsce przechowywania.
      2. Wybierz studnie, które chcesz zdobyć.
3. Wybierz czas ekspozycji dla Texas Red i FITC.
4. Kliknij na Zdobądź Płytę, aby rozpocząć akwizycję, która zajmie około 1 godziny na płytę.

5. Analiza powstawania sieci

1. Użyj programu do przetwarzania obrazów przeznaczonego do analizy naukowych obrazów wielowymiarowych (patrz Spis materiałów) do analizy powstawania NET.
2. Przenieś uzyskane dane obrazu na osobny dysk twardy.
3. Wybierz narzędzie do dodawania kolorów.
   1. Wybierz w1 i wybierz folder na dysku twardym, w którym przechowywane są dane.
   2. Wybierz w2 i wybierz folder na dysku twardym, w którym przechowywane są dane.
      nuta: Użyj standardowego makra, które używa w1 w nazwie pliku, aby dodać czerwony kolor do obrazów Texas Red i używa w2, aby dodać zielony kolor do obrazów FITC.
4. Wybierz opcję Makro analizy.
   1. Wybierz w1 i wybierz wartość progową (próg intensywności), która zwykle wynosi 10. Wybierz żądaną wartość piksela (próg rozmiaru, np. 100).
   2. Wybierz w2 i wybierz wartość progową (próg intensywności), która zwykle wynosi 10. Wybierz żądaną wartość piksela (próg rozmiaru, np. 500).
   3. Wybierz miejsce docelowe dla pliku arkusza kalkulacyjnego, uruchom analizę, a następnie zapisz pliki dziennika.
5. Analizowanie danych w arkuszu kalkulacyjnym.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sterylna woda H2O	B. Braun, Melsungen, Niemcy	12604052
Surowica płodowa bydlęca (FBS)	Bodinco, Alkmaar, Holandia		Stosowany w wysokich stężeniach może wpływać na tworzenie się NET
Ficoll 5,7% - amidotrizoaat o gęstości 9% 1,077 g / ml	LUMC, Leiden, Holandia	97902861
Immunofluorescencyjny mikroskop konfokalny	Image Xpress Micro Confocal (Molecular Devices, Sunnyvale, Kalifornia, Stany Zjednoczone)
Neutralizacja PBS (10x)	Gibco, Paisley, Wielka Brytania	Nr kat. 70011-036
Penicylina / streptomycyna (p/s)	Gibco, Paisley, Wielka Brytania	15070063
RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej (1x)	Gibco, Paisley, Wielka Brytania	Numer katalogowy 11835-063	Czerwień fenolowa może zakłócać sygnał immunofluorescencji
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	B. Braun, Melsungen, Niemcy	174628062
PKH26 2 uM Łącznik komórek fluorescencyjnych w kolorze czerwonym	Sigma Aldrich Saint-Louis, MO, Stany Zjednoczone	PKH26GL-1KT	PKH to opatentowane barwniki fluorescencyjne i technologia znakowania komórek nazwana na cześć ich odkrywcy Paula Karla Horana
Program do naukowej analizy obrazów wielowymiarowych	ImageJ, Oddział Usług Badawczych, Narodowy Instytut Zdrowia Psychicznego, Bethesda, Maryland, USA
Prędkość obrotowa średnia 1640 (1x)	Gibco, Paisley, Wielka Brytania	Numer katalogowy: 52400-025
Sytox zielony 5 mM Nieprzepuszczalny barwnik DNA	Gibco, Paisley, Wielka Brytania	Numer katalogowy: 57020
Niebieska plama trypanowa 0,4%	Sigma Aldrich, Niemcy	Numer katalogowy: 17942E
96-dołkowa,, płaskodenna płytka poddana kulturze tkankowej	Falcon, Nowy Jork, Stany Zjednoczone	353219