Indukcja i wizualizacja zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili we wstępnie znakowanych neutrofilach

Streszczenie

Źródło: Arends, E. J. et al., Wysokoprzepustowy test do oceny i ilościowego określania tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili.J. Vis. Exp.(2019 rok)

Ten film demonstruje indukcję i wizualizację zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili lub NET w wstępnie oznakowanych neutrofilach przy użyciu surowicy pacjenta zawierającej przeciwciała cytoplazmatyczne anty-neutrofilowe. Co więcej, zastosowanie nieprzepuszczalnego barwnika DNA i mikroskopii fluorescencyjnej umożliwia wizualizację NET.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.

1. Izolacja zdrowych neutrofili

1. Pobrać 20 ml krwi obwodowej od zdrowego dawcy w dwóch probówkach pokrytych kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) o pojemności 10 ml.
2. Umieść 10 ml krwi w sterylnej probówce o pojemności 50 ml i dodaj sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do 32,5 ml.
3. Dodaj gradient gęstości (np. Ficoll-amidotrizoaat) pod komórkami.
   <....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sterylna woda H2O	B. Braun, Melsungen, Niemcy	12604052
Surowica płodowa bydlęca (FBS)	Bodinco, Alkmaar, Holandia		Stosowany w wysokich stężeniach może wpływać na tworzenie się NET
Ficoll 5,7% - amidotrizoaat o gęstości 9% 1,077 g / ml	LUMC, Leiden, Holandia	97902861
Immunofluorescencyjny mikroskop konfokalny	Image Xpress Micro Confocal (Molecular Devices, Sunnyvale, Kalifornia, Stany Zjednoczone)
Neutralizacja PBS (10x)	Gibco, Paisley, Wielka Brytania	Nr kat. 70011-036
Penicylina / streptomycyna (p/s)	Gibco, Paisley, Wielka Brytania	15070063
RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej (1x)	Gibco, Paisley, Wielka Brytania	Numer katalogowy 11835-063	Czerwień fenolowa może zakłócać sygnał immunofluorescencji
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	B. Braun, Melsungen, Niemcy	174628062
PKH26 2 uM Łącznik komórek fluorescencyjnych w kolorze czerwonym	Sigma Aldrich Saint-Louis, MO, Stany Zjednoczone	PKH26GL-1KT	PKH to opatentowane barwniki fluorescencyjne i technologia znakowania komórek nazwana na cześć ich odkrywcy Paula Karla Horana
Program do naukowej analizy obrazów wielowymiarowych	ImageJ, Oddział Usług Badawczych, Narodowy Instytut Zdrowia Psychicznego, Bethesda, Maryland, USA
Prędkość obrotowa średnia 1640 (1x)	Gibco, Paisley, Wielka Brytania	Numer katalogowy: 52400-025
Sytox zielony 5 mM Nieprzepuszczalny barwnik DNA	Gibco, Paisley, Wielka Brytania	Numer katalogowy: 57020
Niebieska plama trypanowa 0,4%	Sigma Aldrich, Niemcy	Numer katalogowy: 17942E
96-dołkowa,, płaskodenna płytka poddana kulturze tkankowej	Falcon, Nowy Jork, Stany Zjednoczone	353219