Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Izolacja zdrowych neutrofili
- Pobrać 20 ml krwi obwodowej od zdrowego dawcy w dwóch probówkach pokrytych kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) o pojemności 10 ml.
- Umieść 10 ml krwi w sterylnej probówce o pojemności 50 ml i dodaj sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do 32,5 ml.
- Dodaj gradient gęstości (np. Ficoll-amidotrizoaat) pod komórkami.
- Pobrać 14 ml gradientu gęstości za pomocą pipety 10 ml i kontrolera pipety.
- Umieścić pipetę na dnie probówki o pojemności 50 ml.
- Zdjąć kontroler pipety z pipety, pozwalając, aby gradient gęstości wypłynął z pipety grawitacyjnie, aż do osiągnięcia maksimum przez efekt kapilarny (pozostanie 1-2 ml), bez użycia silnika.
- Wyjmij pipetę, kładąc kciuk na jej wierzchu, zapobiegając w ten sposób wyciekaniu gradientu gęstości podczas wyjmowania pipety.
- Wiruj rurki przez 20 minut przy 912 x g i temperaturze pokojowej (RT) bez przyspieszania i hamowania.
UWAGA: Czerwone krwinki (RBC) i neutrofile mają dużą gęstość i znajdują się na dnie probówki o pojemności 50 ml. Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) są oddzielone i znajdują się na szczycie gradientu gęstości jako biały pierścień. Osocze rozcieńczone PBS będzie znajdować się powyżej PBMC. W razie potrzeby PBMC można wyizolować, przenosząc biały pierścień do nowej probówki o pojemności 50 ml z dodatkowymi etapami przemywania solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
- Ostrożnie usuń najpierw biały pierścień zawierający PBMC, następnie usuń osocze rozcieńczone PBS, a na końcu warstwę gradientu gęstości tak bardzo, jak to możliwe.
- Aby wyizolować neutrofile z mieszaniny neutrofili/erytrocytów, należy lizować erytrocyty zimną sterylną wodą destylowaną.
- Weź z lodówki zimną sterylną butelkę na wodę destylowaną i 10x skoncentrowaną kolbę PBS.
- Pracuj szybko nad tym krokiem. Dodaj 36 ml zimnej, sterylnej wody destylowanej bezpośrednio na wierzch granulki i dokładnie wymieszaj. Dodaj 4 ml 10x PBS po 20 s, aby uzyskać roztwór izotoniczny. Dokładnie wymieszaj raz.
- Wirować rurkę przez 5 minut przy 739 x g i 4 °C (w celu usunięcia erytrocytów). Neutrofile będą znajdować się w białym granule.
- Ostrożnie wyrzucić supernatant. Wykonaj ponownie krok 1.6.2 i upewnij się, że pellet jest prawidłowo zawieszony.
- Wirować rurkę przez 5 minut w temperaturze 328 x g i 4 °C.
- Ostrożnie usunąć sklarowany osad i ponownie zawiesić osad w 5 ml PBS. Policz neutrofile i trzymaj je na lodzie.
UWAGA: Oczekiwana wydajność z 1 probówki krwi (10 ml) wynosi około 15-75 milionów neutrofili.
2. Znakowanie neutrofili czerwoną fluorescencyjną komórką
- Wykonać zawiesinę neutrofili 10-20 milionów neutrofili w 2 ml PBS w probówce o pojemności 15 ml.
- Przygotować roztwór 2 ml PBS z 4 μl łącznika komórek czerwonej fluorescencji 2 μM (patrz tabela materiałów) w innej probówce o pojemności 15 ml. Dodaj go delikatnie do zawiesiny neutrofili i dokładnie wymieszaj.
- Inkubować w ciemności dokładnie przez 25 minut w temperaturze 37 °C, aby oznaczyć neutrofile łącznikiem komórek czerwonej fluorescencji.
- Dezaktywować etykietę, dodając pożywkę Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 zawierającą 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w temperaturze pokojowej do 15 ml i dokładnie wymieszać. Upewnij się, że osad jest ostrożnie ponownie zawieszony, jeśli uformował się pellet.
- Wiruj rurkę przez 5 minut przy 328 x g i RT.
- Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml pożywki RPMI 1640 wolnej od czerwieni fenolowej zawierającej 2% FBS i 10% penicyliny/streptomycyny (P/S) w temperaturze pokojowej. Policz neutrofile.
nuta: Po znakowaniu komórek metodą czerwonej fluorescencji może dojść do utraty komórek o 50%.
3. Indukcja tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili
- Wykonać zawiesinę komórek 0,42 x 106 komórek/ml w pożywce RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej zawierającej 2% FBS i 10% P/S.
- Dodaj 37 500 neutrofili w 90 μl na studzienkę w czarnej 96-dołkowej płytce z płaskim dnem.
- Dodać 10 μl wybranego bodźca (np. surowicy pacjenta) w trzech egzemplarzach, aby osiągnąć stężenie 10% w studzience. Należy zawsze dołączyć kontrolę ujemną (pożywkę) w trzech egzemplarzach.
- Inkubować w ciemności w temperaturze 37 °C przez żądany czas, od 30 minut do 2, 4 lub 6 godzin. Zaleca się inkubację przez 4 godziny.
- Obliczyć objętość potrzebną do dodania 25 μl 5 μM nieprzepuszczalnego barwnika DNA (patrz tabela materiałów), aby osiągnąć końcowe stężenie 1 μM w studzience. W razie potrzeby rozcieńczyć wstępnie w pożywce RPMI 1640 zawierającej 2% FBS i 10% P/S, aby uzyskać stężenie 5 μM.
- Dodać 25 μl 5 μM nieprzepuszczalnego barwnika DNA na 15 minut przed końcem czasu inkubacji. Kontynuować inkubację przez kolejne 15 minut w temperaturze 37 °C w ciemności.
- Usunąć supernatant (~125 μL) bardzo ostrożnie i przechowywać go w razie potrzeby. Dodać 100 μl 4% paraformaldehydu (PFA). Trzymaj się w ciemności i natychmiast przejdź do kroku 4.
4. Wizualizacja zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET) za pomocą mikroskopii konfokalnej 3D o wysokiej zawartości i wysokiej rozdzielczości
- Skonfiguruj ustawienia w immunofluorescencyjnym mikroskopie konfokalnym, klikając Ustawienia akwizycji.
- Kliknij kartę Konfiguruj.
- Wybierz obiektyw i kamerę. Wybierz obiektyw 10X Apo Lambda z trybem akwizycji konfokalnego otworka 60 μm.
- Kliknij na Talerz i wybierz 96-dołkową plastikową płytkę. Wybierz witryny, które chcesz odwiedzić, i wybierz ustaloną liczbę witryn. Wypełnij 3 kolumny i 3 rzędy bez zachodzenia na siebie (0 μm), które pokrywają łącznie 45% studni.
- Kliknij Przejęcie. Wybierz opcję Włącz ustawianie ostrości na podstawie lasera. W razie potrzeby wybierz opcję Uzyskaj serię Z/szereg czasowy.
- Kliknij Autofokus witryny.
- Kliknij Focus on Plate Bottom (Ostrość na dnie) | Offset by Bottom Thickness (Przesunięcie o grubość dna). Aby początkowa studnia znalazła próbkę, wybierz pierwszą zdobytą studnię. Dla autofokusa witryny wybierz wszystkie witryny.
- Kliknij Długości fal.
- Jako liczbę długości fal wybierz 2. Jako poziom zagęszczenia korekcji cieniowania TL wybierz 2.
- W polu Wavelength 1 (Długość fali 1) wybierz opcję Texas Red.
- Jako opcje autofokusa wybierz laser z przesunięciem Z, po przesunięciu lasera 1,1 μm. Użyj stosu Z z niestandardowym zakresem 200-10.
- Dla długości fali 2 wybierz izotiocyjanian fluoresceiny (FITC).
- Jako opcje autofokusa wybierz laser z przesunięciem Z od w1 0 μm. Użyj stosu Z z niestandardowym zakresem 200-10.
- Jako opcje akwizycji wybierz Seria Z i maksimum obrazu projekcji 2D. Jako opcje akwizycji wybierz opcję Korekcja cieniowania | Wył.
- Wybierz opcję Z Series (Seria Z). Wybierz liczbę kroków: 10. Wybierz rozmiar kroku: 3 μm (całkowity zakres wyniesie 27 μm).
- Umieść płytkę w immunofluorescencyjnym mikroskopie konfokalnym.
- Kliknij kartę Uruchom.
- Wypełnij nazwę i opis tablicy rejestracyjnej i wybierz miejsce przechowywania.
- Wybierz studnie, które chcesz zdobyć.
- Wybierz czas ekspozycji dla Texas Red i FITC.
- Kliknij na Zdobądź Płytę, aby rozpocząć akwizycję, która zajmie około 1 godziny na płytę.
5. Analiza powstawania sieci
- Użyj programu do przetwarzania obrazów przeznaczonego do analizy naukowych obrazów wielowymiarowych (patrz Spis materiałów) do analizy powstawania NET.
- Przenieś uzyskane dane obrazu na osobny dysk twardy.
- Wybierz narzędzie do dodawania kolorów.
- Wybierz w1 i wybierz folder na dysku twardym, w którym przechowywane są dane.
- Wybierz w2 i wybierz folder na dysku twardym, w którym przechowywane są dane.
nuta: Użyj standardowego makra, które używa w1 w nazwie pliku, aby dodać czerwony kolor do obrazów Texas Red i używa w2, aby dodać zielony kolor do obrazów FITC.
- Wybierz opcję Makro analizy.
- Wybierz w1 i wybierz wartość progową (próg intensywności), która zwykle wynosi 10. Wybierz żądaną wartość piksela (próg rozmiaru, np. 100).
- Wybierz w2 i wybierz wartość progową (próg intensywności), która zwykle wynosi 10. Wybierz żądaną wartość piksela (próg rozmiaru, np. 500).
- Wybierz miejsce docelowe dla pliku arkusza kalkulacyjnego, uruchom analizę, a następnie zapisz pliki dziennika.
- Analizowanie danych w arkuszu kalkulacyjnym.
