Izolacja lipidów z neutrofili pochodzenia ludzkiego przez separację dwufazową

Streszczenie

Źródło: Brogden, G., et al. Metody badania zmian lipidowych w neutrofilach i późniejszego tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film demonstruje izolację lipidów od ludzkich neutrofili za pomocą dwufazowego systemu rozpuszczalnikowego z użyciem metanolu i chloroformu.

Protokół

1. Izolacja lipidów i analiza neutrofili pochodzących z ludzkiej krwi

1. Weź neutrofile i umieść je na lodzie.
2. Na lodzie odpipetować neutrofile (obecne w roztworze metanolu i chloroformu) do szklanej probówki o pojemności 15 ml z nakrętką z politetrafluoroetylenu (PTFE) i homogenizować je, wstrząsając przez 1 minutę. Użyj szklanych probówek, aby zapobiec wiązaniu lipidów z powierzchniami z tworzywa sztucznego. Używaj nasadek PTFE, aby zapobiec zanieczyszczeniu gumą/plastikiem.
3. Dodać 2 ml metanolu, a 1 minutę później 1 ml chloroformu. Wstrząsaj ponownie przez 1 minutę.
4. Obracaj szklane rurki z prędkością RT i 50 obr./min przez 30 minut.
5. Frakcję białkową osadzać przez odwirowanie roztworu w temperaturze 7 °C i 1,952 x g przez 10 minut.
6. Ostrożnie zdekantować supernatant do nowej szklanej probówki z nakrętką o pojemności 15 ml, pozostawiając osad zawierający białko. Przechowywać osad w temperaturze -20 °C do przyszłego oznaczania ilościowego.
7. Dodać 1 ml chloroformu, odczekać 1 minutę, dodać 1 ml podwójnie destylowanej wody i odwrócić szklaną rurkę z nakrętką z próbką przez 30 s.
8. Wirować w temperaturze 7 °C i 1,952 x g przez 10 minut i odrzucić górną fazę, aż do warstwy mętnej, ale nie włączając jej.
9. W razie potrzeby należy wykonać opcjonalny dalszy etap oczyszczania, powtarzając krok 1.1.8.
10. Wysuszyć próbki w koncentratorze próżniowym w temperaturze 60 °C i przechowywać je w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą potrzebne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Strzykawka 10 μl	Hamilton	701 NR 10 μl
Kaniula 26G	Braun	4657683
chloroform	Carla Rotha	7331.1
metanol	Carla Rotha	7342.1
Woda	Carla Rotha	3255.1	Nie zawiera endotoksyn