Test uwalniania dehydrogenazy mleczanowej w celu wykrycia infekcji Cryptococcus neoformans w makrofagach

Streszczenie

Źródło: Ball, B., et al. Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions. J. Vis. Exp. (2020)

W tym filmie demonstrujemy test cytotoksyczności do oceny infekcji Cryptococcus neoformans, grzyba chorobotwórczego, u makrofagów. Cytotoksyczność jest określana przez uwalnianie enzymu cytoplazmatycznej dehydrogenazy mleczanowej w wyniku lizy makrofagów spowodowanej zakażeniem Cryptococcus neoformans.

Protokół

1. Weryfikacja infekcji

UWAGA: Korzystając z testu cytotoksyczności, można zmierzyć biegłość w infekcjach. Poniższy protokół podkreśli zastosowanie produktu cytotoksycznego do pomiaru uwalniania LDH (dehydrogenazy mleczanowej). Można również stosować inne produkty cytotoksyczności

1. Przygotowanie zakażenia komórek makrofagów C. neoformans
   1. Przygotowanie komórek grzybów
      1. Używając bulionu glicerynowego, nałóż szczep C. neoformans typu dzikiego (H99) na płytkę agarową z dekstrozą peptonową z ekstraktem drożdżowym (YPD) w celu wyizolowania pojedynczych kolonii.
      2. Inkubować przez noc przez 16 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze statycznym.
      3. Wybierz pojedynczą kolonię dzikiego szczepu C. neoformans i zahoduj ją w 5 ml bulionu YPD w luźno zamkniętej probówce o pojemności 10 ml. Występuj w poczwórnym powiększeniu.
      4. Inkubować przez noc przez 16 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
      5. Następnego dnia subkultury każdej nocnej kultury w rozcieńczeniu 1:100 do 3 ml bulionu YPD.
      6. Zmierz wartości gęstości optycznej (OD_{600 nm}) kultury grzybów, aby określić fazę środkową logarytmiczną. W zależności od spektrofotometru, szczep C. neoformans typu dzikiego osiąga fazę środkową zwykle po 6 do 8 godzinach inkubacji w YPD z ogólnymi wartościami OD_{600 nm} w zakresie od 1,0 do 1,5.
      7. Gdy komórki osiągną środkową fazę logarytmiczną, weź 10 μl porcji zawiesiny komórek grzybów do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i rozcieńcz 1:100 w sterylnym 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
      8. Zebrać i odwirować komórki w ilości 1 500 x g przez 10 minut, delikatnie przemyć osad sterylnym PBS o temperaturze pokojowej i powtórzyć w sumie trzy płukania.
      9. Ponownie zawiesić komórki w pożywce do hodowli komórkowych bez antybiotyków, aby osiągnąć stężenie 1,2 x 10⁸ komórek/ml.
   2. Przygotowanie komórek makrofagów
      1. Wizualizuj każdą studzienkę w płytce 6-dołkowej, aby upewnić się, że komórki osiągnęły 70-80% zbieżności. Alternatywnie można zmierzyć komórki, aby uzyskać ok. 1,2 x 10⁶ komórek makrofagów na studzienkę.
      2. Podgrzej pożywkę uzupełnioną antybiotykiem do temperatury 37 °C przed rozpoczęciem hodowli komórkowej. Upewnij się, że środowisko pracy jest wysterylizowane przed pracami z hodowlą komórkową. Wizualizuj komórki za pomocą mikroskopu świetlnego, aby upewnić się, że komórki przylegają i są zdrowe.
      3. Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z naczynia za pomocą pipety serologicznej lub aspiratora próżniowego.
      4. Delikatnie dodaj 5-7 ml sterylnego PBS (soli fizjologicznej buforowanej fosforanami) o temperaturze pokojowej do naczynia o wymiarach 60 x 15 mm.
      5. Delikatnie przechyl naczynie, aby umyć przylegające komórki.
   3. Kohodowla C. neoformans i komórek makrofagów
      1. Dodać 1 ml zawieszonych komórek C. neoformans do 4 studzienek zawierających komórki makrofagów.
         nuta: Wymagana liczba płytek będzie musiała zostać obliczona przed rozpoczęciem eksperymentu. Dodaj 1 ml pożywki wolnej od antybiotyków do pustych studzienek.
      2. Pozostawić komórki do inkubacji w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 3 godziny.
      3. Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z płytki za pomocą pipety serologicznej lub aspiratora próżniowego.
      4. Delikatnie dodaj 1 ml sterylnego PBS o temperaturze pokojowej.
      5. Delikatnie przechyl płytkę, aby umyć nieprzyłączone lub niefagocytozowane zewnątrzkomórkowe komórki C. neoformans.
      6. Dodaj 1 ml pożywki wolnej od antybiotyków do każdego dołka w płytce 6-dołkowej.
      7. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
   4. W wybranych punktach czasowych (np. 1, 3, 6, 12 i 24 godziny) należy pobrać supernatant do pomiaru uwalniania LDH zgodnie z zaleceniami producenta.
   5. W tym samym czasie niezakażone komórki makrofagów zostaną poddane lizie do określonej wartości w celu uzyskania maksymalnej cytotoksyczności.
   6. Obliczyć cytotoksyczność w następujący sposób:
      

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
100 mM Tris-HCl, pH 8,5	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP152-1	Utrzymywać w temperaturze 4°C
Talerz 60 x 15 mm, Nunclon Delta	ThermoFisher Naukowy	174888
6-dołkowa płytka do hodowli komórkowej	ThermoFisher Naukowy	140675
Stożkowe probówki sokoła (15 ml)	Fisher Naukowy	05-539-12
Hrabina II Automatyczny licznik komórek	ThermoFisher Naukowy	AMQAX1000	Nie jest to konieczne, hemocytometr może być używany jako alternatywa.
Test cytotoksyczności nieradioaktywnej CytoTox 96	Preparat Promega	Silnik G1780
DMEM, wysoki poziom glukozy, suplement GlutaMAX	ThermoFisher Naukowy	10566016
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	ThermoFisher Naukowy	12483020	Podgrzewać dezaktywować przez inkubację w temperaturze 60°C przez 30 minut. Przygotować 50 ml porcji i błyskawicznie zamrozić. Rozmrozić przed przygotowaniem podłoża
Hemocytometr	Firma VWR	Lata 15170-208
HEPESY	Sigma Aldrich	H3375	Przygotować 40 mM HEPES/8 M mocznika w roztworze podstawowym luzem, błyskawicznie zamrozić, przechowywać w temperaturze -20°C do momentu użycia. Wyrzuć po każdym użyciu (nie zamrażaj i nie rozmrażaj wielokrotnie).
L-glutamina	ThermoFisher Naukowy	25030081	Może być podwielokrotny i zamrożony do przechowywania. Rozmrozić przed przygotowaniem pożywki.
Mikrowirówka	Eppendorf	13864457
Penicylina : Streptomycyna 10k/10k	Firma VWR	CA12001-692	Może być podwielokrotny i zamrożony do przechowywania. Rozmrozić przed przygotowaniem pożywki.
sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Firma VWR	CA12001-676	Zakup nie jest wymagany. Można również przygotować PBS, ale przed użyciem należy przeprowadzić sterylną filtrację.
Pipeta jednorazowa serologiczna (10 ml)	Fisher Naukowy	13-678-11E
Pipeta serologiczna jednorazowego (25 mL) Basix	Fisher Naukowy	14955235
Mieszanina trypsyny i proteazy Lys-C, stopień stwardnienia rozsianego	przebijać	A40007	Utrzymywać w temperaturze -20 °C.
mocznik	Sigma Aldrich	U1250-1KG	Przygotować 40 mM HEPES/8 M mocznika w roztworze podstawowym luzem, zamrozić błyskawicznie, przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Wyrzuć po każdym użyciu (nie zamrażaj i nie rozmrażaj wielokrotnie).
Rosół z dekstrozy peptonowej z ekstraktem drożdżowym	BD Difco	Zobacz materiał BM20