System infekcji oparty na przepuszczalnej wkładce membranowej do badania wpływu toksyn bakteryjnych

Abstract

Źródło: Flaherty, R. A., et al. Implementacja systemu infekcji opartego na wkładce membranowej do badania wpływu wydzielanych toksyn bakteryjnych na komórki gospodarza ssaków. J. Vis. Exp. (2016).

Ten film demonstruje system infekcji oparty na wkładce membranowej, który pozwala ocenić wpływ wydzielanych toksyn bakteryjnych. Eliminując bezpośredni kontakt między patogenem bakteryjnym a komórkami gospodarza za pomocą przepuszczalnej membrany, technika ta pozwala na badanie wpływu toksyn wydzielanych przez bakterie chorobotwórcze na komórki gospodarza ssaków.

Protocol

1. Kultura bakteryjna

1. Generowanie izogenicznych zmutowanych szczepów do wykorzystania w badaniu określonego czynnika wydzielanego będącego przedmiotem zainteresowania.
   nuta: Szczepy GAS (Streptococcus grupy A) M1T1 5448 wykorzystane w tych eksperymentach obejmowały WT (typ dziki) GAS', kota sagAΔ z niedoborem SLS (sag = gen związany ze streptolizyną S, SLS = Streptolizyna S) mutant (w skrócie w tekście jako ΔsagA) i szczep uzupełniony sagA (w skrócie w tekście jako ΔsagA+sagA).
2. Przygotuj na noc płynne kultury interesujących nas szczepów bakterii. Hoduj szczepy GAS M1T1 5448 w 10 ml bulionu Todda-Hewitta w temperaturze 37 °C przez 16-20 godzin przed zakażeniem komórek ludzkich.
3. Odwirować nocne kultury bakterii (2 400 rcf przez 10 min) i ponownie zawiesić w świeżej pożywce bakteryjnej.
   nuta: Ponowne zawieszenie w tej samej objętości, w której hodowano kultury nocne (5-10 ml), na ogół daje pożądaną początkową gęstość optyczną.
4. Znormalizować kultury bakteryjne do równych stężeń początkowych poprzez rozcieńczenie ponownie zawieszonych kultur w dodatkowym pożywce bakteryjnej, aż do uzyskania tej samej gęstości optycznej przy 600 nm (OD₆₀₀) dla wszystkich szczepów, które mają być badane (dla wygody zaleca się OD₆₀₀ około 1,0).
   nuta: W badaniach tych wykorzystano hodowle bakterii w fazie stacjonarnej do zakażenia komórek gospodarza natychmiast po normalizacji. Ponieważ jednak niektóre szczepy bakterii wychodzą z fazy stacjonarnej niesynchronicznie, bardziej odpowiednie może być rozpoczęcie infekcji gospodarza od kultur w fazie logarytmicznej, jeśli okaże się, że ma to miejsce w przypadku szczepów będących przedmiotem zainteresowania.
5. Przed dalszą analizą należy wykonać test zliczania kolonii w celu określenia jednostek tworzących kolonie (CFU) na mililitr obecnych w kulturach wyjściowych, aby można było określić liczbę infekcji (MOI) lub stosunek bakterii na komórkę gospodarza.
   1. Przygotować 1 ml seryjnych rozcieńczeń kultur bakteryjnych, które zostały znormalizowane do pożądanej gęstości optycznej w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) lub odpowiedniej pożywce do wzrostu bakterii (w tych badaniach użyto bulionu Todda-Hewitta). Przygotuj rozcieńczenia w zakresie od ^10-1 do ^10-6, aby wytworzyć co najmniej jeden zestaw płytek agarowych z policzalnymi koloniami (30-300 kolonii). Wykonać wszystkie rozcieńczenia w trzech powtórzeniach.
   2. Przenieść 100 μl każdego seryjnego rozcieńczenia na płytkę agarową zawierającą pożywkę odpowiednią dla analizowanych gatunków bakterii.
      nuta: W badaniach tych użyto agaru Todda-Hewitta.
   3. Użyj szklanego lub plastikowego rozsiewacza bakteryjnego, aby równomiernie rozprowadzić 100 μl porcji na całej powierzchni płytki agarowej i kontynuuj rozprowadzanie, aż płyn zostanie wchłonięty przez agar. Wykonuj pod ogniem przy użyciu sterylnej techniki.
   4. Inkubować płytki agarowe w temperaturze 37 °C przez noc lub do momentu pojawienia się policzalnych kolonii.
   5. Policz kolonie, które rosną na każdej płytce i oblicz jtk/ml w oryginalnej kulturze według następującego wzoru: liczba kolonii x odwrotność szeregowego rozcieńczenia/objętości kultury podanej w mililitrach.
      np. (200 kolonii x 1/^10-5 rozcieńczenia) / 0,1 ml na platerze = 2,0 x 10⁸ jtk/ml.

2. Hodowla komórek gospodarza

1. Uzyskać odpowiednią linię komórek gospodarza do żądanych analiz.
   nuta: Do badań wykorzystano ludzkie keratynocyty nabłonkowe HaCaT, swoisty dar V. Nizeta.
   1. Utrzymuj komórki HaCaT w 100-milimetrowych szalkach hodowlanych w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) z 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS). Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .

3. Zakażenie komórek gospodarza za pomocą systemu wkładania membrany przepuszczalnej

1. Umieść komórki w odpowiednich naczyniach do hodowli tkankowej i pozwól im rosnąć, aż osiągną 90% zlewności.
   nuta: Komórki HaCaT używane w tych badaniach zazwyczaj osiągają konfluencję w ciągu 2-3 dni po posiewie.
   1. Do zbierania lizatu (np. analiza sygnalizacji i oznaczanie trifosforanu adenozyny (ATP)) umieść komórki HaCaT w 6 dołkach przy gęstości wysiewu około 3 x 10⁵ komórek/dołek.
   2. Do eksperymentów obrazowania immunofluorescencyjnego, płytki komórkowe na sterylnych szklanych szkiełkach nakrywkowych w 6 dołkach o gęstości wysiewu około 3 x 10⁵ komórek / dołek.
   3. W przypadku testów przepuszczalności błony homodimeru etydyny i uwalniania dehydrogenazy mleczanowej (LDH) umieść komórki HaCaT w 24 dołkach przy gęstości wysiewu około 5 x 10⁴ komórek / studzienkę.
2. Bezpośrednio przed zabiegiem przemyć komórki 1x sterylnym PBS.
3. Nałóż świeżą pożywkę wzrostową na komórki. W opisanych tutaj warunkach należy zastosować 2 ml pożywki na dołek w przypadku płytek 6-dołkowych lub 0,5 ml pożywki na dołek w przypadku płytek 24-dołkowych. Jeśli testowane są terapie farmakologiczne, wymieszaj je ze świeżą pożywką i zastosuj na tym etapie.
   Uwaga: Niektóre testy mogą wymagać alternatywnych pożywek. Na przykład, ponieważ czerwień fenolowa i wysokie stężenia w surowicy zakłócają test uwalniania LDH, do tych eksperymentów wykorzystano zmodyfikowaną pożywkę orła (DMEM) firmy Dulbecco wolną od czerwieni fenolowej uzupełnioną 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) (w/v), 2 mM L-glutaminy i 1 mM pirogronianu sodu.
4. Po nałożeniu świeżej pożywki ostrożnie umieścić sterylną wkładkę membranową o przepuszczalności 0,4 μm w każdym dołku. Wykonaj ten krok w okapie z przepływem laminarnym i użyj sterylnych kleszczyków, aby przenieść przepuszczalną wkładkę membranową do każdej studzienki.
5. Zastosuj świeżą pożywkę do hodowli komórkowych do górnej komory każdej studzienki zgodnie z instrukcjami producenta. W opisanych tutaj warunkach należy zastosować 1 ml pożywki na dołek dla płytek 6-dołkowych lub 0,1 ml pożywki na basenik dla płytek 24-dołkowych.
6. Nałożyć odpowiednią objętość znormalizowanych kultur bakteryjnych (patrz sekcja 1) do górnej komory systemu wkładów membranowych przepuszczalnych. Stosować pożywkę bakteryjną do niezakażonych zabiegów kontrolnych. Aby uzyskać opisane tutaj wyniki, dodaj 25 μl znormalizowanych kultur na komorę dla płytek 24-dołkowych i 100 μl kultur na komorę dla płytek 6-dołkowych.
   Uwaga: W tych badaniach GAS typu dzikiego lub zmutowanego zastosowano do komórek gospodarza przy MOI 10. MOI obliczono na podstawie końcowej liczby komórek eukariotycznych (np. 2 x 10⁶ komórek/studzienkę), tak że na początku okresu infekcji dodano 10 razy więcej bakterii na komórkę gospodarza (np. 2 x 10⁷ CFU na studzienkę). Odpowiedni MOI będzie się różnić w zależności od gatunku bakterii i pożądanych analiz uzupełniających.
   nuta: Oprócz stosowania pożywki bakteryjnej do niezakażonych kontroli, inne przydatne kontrole do niektórych zastosowań tej techniki mogą obejmować bakterie zabijane termicznie lub zużyte podłoże bakteryjne dla porównania.
7. Inkubować zakażone komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .

4. Pobieranie próbek

1. Aby pobrać pożywkę do hodowli komórkowych, lizaty komórek gospodarza lub szklane szkiełka nakrywkowe z nienaruszonymi komórkami do dalszych analiz, należy rozpocząć od ostrożnego usunięcia przepuszczalnej wkładki membranowej za pomocą sterylnych kleszczyków.
2. Do oceny wydzielanych białek gospodarza:
   1. Zebrać pożywkę z dolnej komory do probówek o pojemności 1,5 ml. Unikaj naruszania monowarstwy podczas zbierania.
   2. Odwirować próbki w temperaturze 14 000 rcf przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórkowych.
   3. Usunąć całość z wyjątkiem 50 μl supernatantu do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C lub natychmiast zużyć.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rosół Todda-Hewitta	Acumedia (język angielski)	Zobacz materiał 7161A	Użyj odpowiedniego bulionu dla interesujących gatunków bakterii.
Biospektrometr	Eppendorf	Model podstawowy	Odpowiedni jest każdy spektrofotometr UV-Vis.
Szalki Petriego	Fisher Naukowy	FB0875713	Inne marki są odpowiednie.
agar	Sigma	A1296-1kg	Inne marki są odpowiednie.
Ludzkie keratynocyty nabłonkowe HaCaT			Prezent od laboratorium Victora Nizeta.
Zmodyfikowany Medium Orła Dulbecco (DMEM)	Technologie życiowe	Numer katalogowy 11995-073	Użyj odpowiedniej pożywki dla interesującej Cię linii komórkowej.
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Biowest (Zachód Biologi	Zobacz materiał S162H	Używaj odpowiednich dodatków do pożywek dla interesującej nas linii komórkowej.
Naczynia do hodowli tkankowych 10 cm	Nunc	Numer katalogowy: 150350	Inne marki są odpowiednie.
6-dołkowe naczynia do hodowli tkankowych	CytoOne	CC7682-7506	Inne marki są odpowiednie, ale muszą być kompatybilne z wkładką Corning.
24-dołkowe szalki do hodowli tkankowych	CytoOne	CC7682-7524	Inne marki są odpowiednie, ale muszą być kompatybilne z wkładką Corning.
Szkiełka nakrywkowe szklane	Marka rybacka	12-541-B	Muszą one zostać autoklawizowane przed użyciem do posiewu komórek.
sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy 10010-023
DMEM bez czerwieni fenolowej	Technologie życiowe	31053028	Pożywka bez czerwieni fenolowej jest wymagana tylko do oznaczania uwalniania LDH.
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP1600-100
L-glutamina	Gibco (firma Gibco)	25030149	Wymagane tylko do uzupełnienia pożywki do hodowli komórkowych w teście uwalniania LDH.
Pirogronian sodu	Gibco (firma Gibco)	BP356100	Wymagane tylko do uzupełnienia pożywki do hodowli komórkowych w teście uwalniania LDH.
Powlekane kolagenem wkładki Transwell 0,4 μm (6 dołków)	Corning	3540
Powlekane kolagenem wkładki Transwell 0,4 μm (24 dołki)	Corning	3595
Kleszcze	rybak	3120018	Muszą one zostać wysterylizowane etanolem przed użyciem wkładek Transwell.
Skrobaki komórkowe	Marka rybacka	08-100-241	Są one wymagane tylko do zbierania lizatów komórkowych.