1. Kultura bakteryjna
- Generowanie izogenicznych zmutowanych szczepów do wykorzystania w badaniu określonego czynnika wydzielanego będącego przedmiotem zainteresowania.
nuta: GASM1T1 5448 szczepów Streptococcus wykorzystanych w tych eksperymentach obejmowały WT GAS', mutanta z niedoborem SLSu kota sagAΔ (w skrócie ΔsagA) oraz szczep uzupełniony sagA (w skrócie ΔsagA+sagA).
- Przygotuj na noc płynne kultury interesujących nas szczepów bakterii. Hoduj szczepy GAS M1T1 5448 w -10 ml bulionu Todda-Hewitta w temperaturze 37°C przez 16-20 godzin przed zakażeniem komórek ludzkich.
- Odwirować nocne kultury bakterii (2 400 rcf przez 10 min) i ponownie zawiesić w świeżej pożywce bakteryjnej.
nuta: Ponowne zawieszenie w tej samej objętości, w której hodowano kultury nocne (5-10 ml), na ogół daje pożądaną początkową gęstość optyczną.
- Normalizować kultury bakteryjne do równych stężeń początkowych poprzez rozcieńczanie ponownie zawieszonych kultur w dodatkowym pożywce bakteryjnej, aż do uzyskania tej samej gęstości optycznej przy 600 nm (OD600) dla wszystkich szczepów, które mają być badane (dla wygody zaleca się OD600 około 1,0).
nuta: W badaniach tych wykorzystano hodowle bakterii w fazie stacjonarnej do zakażenia komórek gospodarza natychmiast po normalizacji. Ponieważ jednak niektóre szczepy bakterii wychodzą z fazy stacjonarnej niesynchronicznie, bardziej odpowiednie może być rozpoczęcie infekcji gospodarza od kultur w fazie logarytmicznej, jeśli okaże się, że ma to miejsce w przypadku szczepów będących przedmiotem zainteresowania.
- Przed dalszą analizą należy wykonać test zliczania kolonii w celu określenia jednostek tworzących kolonie (CFU) na mililitr obecnych w kulturach wyjściowych, aby można było określić liczbę infekcji (MOI) lub stosunek bakterii na komórkę gospodarza.
- Przygotować 1 ml seryjnych rozcieńczeń kultur bakteryjnych, które zostały znormalizowane do pożądanej gęstości optycznej w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) lub odpowiedniej pożywce do wzrostu bakterii (w tych badaniach użyto bulionu Todda-Hewitta). Przygotuj rozcieńczenia w zakresie od 10-1 do 10-6, aby wytworzyć co najmniej jeden zestaw płytek agarowych z policzalnymi koloniami (30-300 kolonii). Wykonać wszystkie rozcieńczenia w trzech powtórzeniach.
- Przenieść 100 μl każdego seryjnego rozcieńczenia na płytkę agarową zawierającą pożywkę odpowiednią dla analizowanych gatunków bakterii.
nuta: W badaniach tych użyto agaru Todda-Hewitta.
- Użyj szklanego lub plastikowego rozsiewacza bakteryjnego, aby równomiernie rozprowadzić 100 μl porcji na całej powierzchni płytki agarowej i kontynuuj rozprowadzanie, aż płyn zostanie wchłonięty przez agar. Wykonuj pod ogniem przy użyciu sterylnej techniki.
- Inkubować płytki agarowe w temperaturze 37°C przez noc lub do momentu pojawienia się policzalnych kolonii.
- Policz kolonie, które rosną na każdej płytce i oblicz jtk/ml w oryginalnej kulturze według następującego wzoru: liczba kolonii x odwrotność szeregowego rozcieńczenia/objętości kultury podanej w mililitrach.
np. (200 kolonii x 1/10-5 rozcieńczenia) / 0,1 ml w półmisku = 2,0 x 108 jtk/ml
2. Hodowla komórek gospodarza
- Uzyskać odpowiednią linię komórek gospodarza do żądanych analiz.
nuta: Do badań wykorzystano ludzkie keratynocyty nabłonkowe HaCaT29, swoisty dar V. Nizeta.
- Utrzymuj komórki HaCaT w 100-milimetrowych szalkach hodowlanych w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) z 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS). Inkubować w temperaturze 37°C z 5% CO2 .
3. Zakażenie komórek gospodarza za pomocą systemu wkładania membrany przepuszczalnej
- Umieść komórki w odpowiednich naczyniach do hodowli tkankowej i pozwól im rosnąć, aż osiągną 90% zlewności.
Uwaga: Komórki HaCaT użyte w tych badaniach zazwyczaj osiągają konfluencję w ciągu 2-3 dni po posiewaniu.
- Do zbierania lizatu (np. analiza sygnalizacji i oznaczanie trifosforanu adenozyny (ATP)) umieść komórki HaCaT w 6 dołkach przy gęstości wysiewu około 3 x 105 komórek/dołek.
- Do eksperymentów obrazowania immunofluorescencyjnego, płytki komórkowe na sterylnych szklanych szkiełkach nakrywkowych w 6 dołkach o gęstości wysiewu około 3 x 105 komórek / dołek.
- W przypadku testów przepuszczalności błony homodimeru etydyny i uwalniania dehydrogenazy mleczanowej (LDH) umieść komórki HaCaT w 24 dołkach przy gęstości wysiewu około 5 x 104 komórek / studzienkę.
- Bezpośrednio przed zabiegiem przemyć komórki 1x sterylnym PBS.
- Nałóż świeżą pożywkę wzrostową na komórki. W opisanych tutaj warunkach należy zastosować 2 ml pożywki na dołek w przypadku płytek 6-dołkowych lub 0,5 ml pożywki na dołek w przypadku płytek 24-dołkowych. Jeśli testowane są terapie farmakologiczne, wymieszaj je ze świeżą pożywką i zastosuj na tym etapie.
nuta: Niektóre testy mogą wymagać alternatywnych pożywek. Na przykład, ponieważ czerwień fenolowa i wysokie stężenia w surowicy zakłócają test uwalniania LDH, do tych eksperymentów wykorzystano DMEM wolny od czerwieni fenolowej uzupełniony 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) (w / v), 2 mM L-glutaminy i 1 mM pirogronianu sodu.
- Po nałożeniu świeżej pożywki ostrożnie umieścić sterylną wkładkę membranową o przepuszczalności 0,4 μm w każdym dołku. Wykonaj ten krok w okapie z przepływem laminarnym i użyj sterylnych kleszczyków, aby przenieść przepuszczalną wkładkę membranową do każdej studzienki.
- Zastosuj świeżą pożywkę do hodowli komórkowych do górnej komory każdej studzienki zgodnie z instrukcjami producenta. W opisanych tutaj warunkach należy zastosować 1 ml pożywki na dołek dla płytek 6-dołkowych lub 0,1 ml pożywki na basenik dla płytek 24-dołkowych.
- Nałożyć odpowiednią objętość znormalizowanych kultur bakteryjnych (patrz sekcja 1) do górnej komory systemu wkładów membranowych przepuszczalnych. Stosować pożywkę bakteryjną do niezakażonych zabiegów kontrolnych. Aby uzyskać opisane tutaj wyniki, dodaj 25 μl znormalizowanych kultur na komorę dla płytek 24-dołkowych i 100 μl kultur na komorę dla płytek 6-dołkowych.
Uwaga: W tych badaniach GAS typu dzikiego lub zmutowanego zastosowano do komórek gospodarza przy MOI 10. MOI obliczono na podstawie końcowej liczby komórek eukariotycznych (np. 2 x 106 komórek/studzienkę), tak że na początku okresu infekcji dodano 10 razy więcej bakterii na komórkę gospodarza (np. 2 x 107 CFU na studzienkę). Odpowiedni MOI będzie się różnić w zależności od gatunku bakterii i pożądanych analiz uzupełniających.
Uwaga: Oprócz stosowania pożywki bakteryjnej do niezakażonych kontroli, inne przydatne kontrole dla niektórych zastosowań tej techniki mogą obejmować bakterie zabijane termicznie lub zużyte pożywki bakteryjne dla porównania.
- Inkubować zakażone komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
4. Pobieranie próbek
- Aby pobrać pożywkę do hodowli komórkowych, lizaty komórek gospodarza lub szklane szkiełka nakrywkowe z nienaruszonymi komórkami do dalszych analiz, należy rozpocząć od ostrożnego usunięcia przepuszczalnej wkładki membranowej za pomocą sterylnych kleszczyków.
- Do oceny lizatów komórek gospodarza:
- Delikatnie zassać pożywkę powyżej monowarstwy komórek gospodarza. Należy unikać naruszania monowarstwy, ponieważ może to spowodować utratę próbki.
- Wypłucz komórki raz 1x PBS.
- Delikatnie odessać PBS. Natychmiast należy zastosować odpowiednią objętość lodowatego buforu do lizy, aby osiągnąć pożądane stężenie białka, i inkubować próbki na lodzie przez 15 minut. Zastosować od 200 μl do 350 μl buforu do lizy na zagłębienie każdej płytki 6-dołkowej, aby osiągnąć stężenie białka między 0,5 a 1,5 mg/ml.
Uwaga: Bufor do lizy stosowany w tych badaniach składał się z wody dejonizowanej, 1% (v/v) substytutu Nonidet P40, koktajlu inhibitorów fosfatazy i koktajlu inhibitorów proteazy. Konkretne odczynniki są wymienione w sekcji Materiały i sprzęt.
- Za pomocą skrobaka do komórek odłączyć komórki od powierzchni płytki każdego dołka i odpipetować całą zawartość każdej studzienki do probówki o pojemności 1,5 ml.
- Odwirować próbki w temperaturze 14 000 rcf przez 20 minut w temperaturze 4°C.
- Aby ocenić rozpuszczalne składniki lizatu, należy przenieść supernatant do świeżej probówki i przechowywać w temperaturze -20°C lub natychmiast zużyć.
- Aby ocenić jądrowe lub inne nierozpuszczalne składniki lizatu, należy zarezerwować osad i przechowywać go w temperaturze -20°C lub natychmiast zużyć.
