Wykrywanie przylegania bakterii do komórek gospodarza za pomocą obrazowania fluorescencyjnego

Abstract

Źródło: Yang, J., et al. Zautomatyzowane, wysokowydajne wykrywanie przylegania bakterii do komórek gospodarza. J. Vis. Exp. (2021)

Ten film demonstruje test przylegania bakterii do hodowli komórek nabłonkowych oznaczony GFP w celu zbadania dynamiki interakcji gospodarz-patogen za pomocą obrazowania opartego na mikroskopii fluorescencyjnej.

Protocol

1. Przyleganie bakterii i barwienie komórek gospodarza

1. Najpierw umyj monowarstwy komórek A549 z nasionami trzy razy ciepłym 1x PBS. Do każdego mycia dodaj 100 μl 1x PBS do każdej studzienki, delikatnie pipetuj w górę iw dół trzy razy, wyrzuć 1x PBS lub odczekaj 10 s po dodaniu, a następnie odkurz, aby usunąć 1x PBS. Aby określić kinetykę asocjacji bakteryjnej, należy nałożyć na komórki 100 μl pożądanych stężeń zawiesiny bakteryjnej o różnych MOI (0, 1, 10 i 100). Odwirowywać bakterie w ilości 200 x g przez 10 minut i inkubować zakażone komórki A549 w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez dodatkowe 1 h.
   nuta: W tym eksperymencie każdy warunek miał techniczną trójkę.
2. Usuń niezwiązane bakterie, myjąc monowarstwy pięciokrotnie ciepłym 1x PBS, jak opisano powyżej. Dodaj 100 μl 4% formaldehydu (w 1x PBS) do każdej studzienki z 96-dołkowych płytek, aby utrwalić komórki. Pozostaw płytki na lodzie na 15 minut, a następnie zmyj roztwór utrwalający za pomocą 1x PBS trzy razy.
3. Aby wybarwić jądra, dodać 50 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) i inkubować go przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji umyć studzienki trzykrotnie za pomocą 1x PBS. Przykryj zainfekowane komórki A549 100 μl 1x PBS, aby uniknąć wysuszenia. Przygotuj się do następnego kroku lub przechowuj płytkę w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 2 dni w ciemności.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 kanałów PBS	Firma VWR	Numer katalogowy: 45001-130
4′,6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI)	Rybak termiczny	Numer katalogowy: 62248	Barwnik do barwienia komórek gospodarza
Płytka 96-dołkowa	Corning	3882	Dobrze połowa powierzchni, płaskie przezroczyste dno
Ogniwa A549	Kontroler ATCC (Kontroler T	Zobacz materiał CCL 185	Linia komórkowa ssaków
wirówka	Eppendorf	Zobacz materiał 5810R
Fotometr OD600 DiluFotometr	NIEMOC
Typowy bulion sojowy	Growcells (Komórki do uprawy	MBPE-4040 (wersja angielska)
F-12k średni	Kontroler ATCC (Kontroler T	302004	Pożywka do hodowli komórkowych A549
Surowica bydlęca płodu	Corning	35-016-CV