Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Przygotowanie pan-leukocytów
- Pobrać 1 ml krwi obwodowej od zdrowego dawcy (lub pacjenta) w strzykawce z heparyną. Upewnij się, że oddanie krwi zostało zatwierdzone przez właściwą komisję etyczną.
- Wymieszać 1 ml ludzkiej krwi obwodowej z 30 ml buforu do lizy ACK (150 mM NH4Cl, 1 mM KHCO3 i 0,1 mM EDTA, pH 7,0) w probówce o pojemności 50 ml i inkubować przez 8 minut w temperaturze pokojowej.
- Napełnić probówki PBS i odwirować przy 300 x g przez 6 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 30 ml buforu do lizy ACK.
- Powtarzać kroki 1.2 i 1.3 aż do momentu, gdy supernatant będzie klarowny. Na koniec umyć komórki w PBS, odwirować przy 300 x g przez 6 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml pożywki hodowlanej (RPMI1640 + 10% FCS). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 60 minut.
2. Wczytywanie komórek Raji za pomocą SEB
- Przygotuj dwie probówki Falcon o pojemności 15 ml z 1,5 x 106 komórek Raji w probówce. Odwirować komórki (300 x g przez 6 minut w temperaturze pokojowej) i wyrzucić supernatant.
- Ponownie zawiesić komórki w pozostałej pożywce (około 50–100 μl), dodać 1,9 μl (1,9 μG) SEB i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Dodać 5 ml pożywki hodowlanej, odwirować komórki (300 x g przez 6 minut w temperaturze pokojowej) i ponownie zawiesić osad w pożywce hodowlanej (RPMI1640 + 10% FCS) o gęstości 1 x 106 komórek/ml.
3. Indukcja synaps immunologicznych i protokół barwienia
- Odpipetować 500 μl preparatu komórek Raji załadowanych SEB do probówki FACS i 500 μl preparatu niezaładowanych komórek Raji do innej probówki FACS. Dodać 650 μl panleukocytów do każdej probówki i odwirować komórki (300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej). Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 150 μl pożywki hodowlanej (RPMI1640 + 10% FCS). Inkubować w temperaturze 37 °C (zazwyczaj przez 45 minut).
- Delikatnie wiruj komórki (10 s przy 1,000 obr./min) i dodaj 1,5 ml paraformaldehydu (1,5%) podczas wiru, aby utrwalić komórki. Zatrzymaj utrwalanie, dodając 1 ml PBS + 1% BSA. Osadzać komórki (300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml PBS + 1% BSA po inkubacji w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
- Osad (300 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej) i ponownie zawiesić komórki w 100 μl PBS + 1% BSA + 0,1% saponiny przez 15 minut w temperaturze pokojowej w celu przepuszczalności komórek (płytka 96-dołkowa, w kształcie litery U).
- Umyj komórki w PBS + 1% BSA + 0,1% saponiny za pomocą wirowania (300 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej) i ponownie zawieś osad komórkowy w 50 μl PBS + 1% BSA + 0,1% saponiny zawierającej przeciwciała lub związki znakowane fluoroforem (CD3-PE-TxRed (1:30), Phalloidin-AF647 (1:150) i DAPI (1:3,000)).
- Inkubować komórki w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut. Umyj komórki 3 razy, dodając 1 ml PBS + 1% BSA + 0,1% saponiny. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić komórki w 60 μl PBS w celu obrazowania cytometrii przepływowej.
4. Akwizycja obrazu za pomocą cytometru przepływowego
UWAGA: Poniższa procedura pozyskiwania obrazów i analiza danych są oparte na obrazowaniu cytometrii przepływowej przy użyciu oprogramowania takiego jak imagestream (IS100), INSPIRE i IDEAS. Można jednak również stosować inne cytometry przepływowe i oprogramowanie analityczne.
- Otwórz oprogramowanie analityczne na komputerze podłączonym do obrazowego cytometru przepływowego i kliknij Initialize Fluidics w menu Instrument. Zastosuj koraliki na prawym porcie, gdy zostaniesz o to poproszony.
- Załaduj domyślny szablon z menu Plik i kliknij Uruchom/Instalacja. Wybierz Koraliki z menu rozwijanego Widok.
- Dostosuj oświetlacz jasnego pola, klikając Ustaw intensywność, jeśli wskazana wartość jest mniejsza niż 200.
- Uruchom procedurę kalibracji i testu na karcie Pomoc, klikając przycisk Rozpocznij wszystko.
- Kliknij Flush/Lock/Load i zastosuj próbki w lewym porcie, gdy zostaniesz o to poproszony. Po załadowaniu komórek do cytometru przepływowego otwórz klasyfikator komórek i dostosuj wartości w następujący sposób: górna granica intensywności szczytowej na poziomie 1,022 dla każdego kanału, dolna granica intensywności szczytowej na poziomie 50 dla kanału 2 (DAPI) i kanału 5 (CD3-Pe-TxR), dolna granica obszaru na poziomie 50 dla kanału 1 (rozproszenie boczne) i górna granica na poziomie 1,500.
- Zmień moc lasera wzbudzenia na 405 nm (15 mW), 488 nm (200 mW) i 647 nm (90 mW) w zakładce Ustawienia.
- Przełącz menu rozwijane Widok między komórkami i koralikami, aby ocenić klasyfikator komórek i dostosowanie mocy lasera.
nuta: Upewnij się, że wszystkie komórki i pary komórek znajdują się w widoku komórki, a grudki komórek, zanieczyszczenia i obrazy z nasyconymi pikselami znajdują się w widoku zanieczyszczeń, zmieniając klasyfikatory komórek i/lub moc lasera wzbudzenia.
- Zdefiniuj nazwę próbki i liczbę obrazów do pobrania (15 000–25 000 dla próbek i 500 dla kontrolek kompensacji) na karcie Ustawienia. Kliknij Uruchom/Ustawienia, aby rozpocząć pobieranie.
