UWAGA: Wszystkie techniki przygotowania pożywki i hodowli komórkowej są przeprowadzane w warunkach aseptycznych przy użyciu komory bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym. Wszystkie opisane etapy inkubacji kultur przeprowadza się przy użyciu inkubatora zaprojektowanego do utrzymywania atmosfery o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%.
1. Hodowla komórkowa
- Przygotowanie podłoża wzrostowego
- W przypadku MSC (mezenchymalne komórki macierzyste) i LADMAC (makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego myszy; pochodzi od nazwisk badaczy, którzy ustanowili linię komórkową: Laskin, Dower i Malech), dodaj 50 ml FBS i 5 ml 100x mieszanki antybiotykowo-grzybiczej do 500 ml DMEM o wysokiej zawartości glukozy (zmodyfikowana pożywka Eagle firmy Dulbecco).
- W przypadku makrofagów (MΦ) dodać 50 ml FBS, 100 ml pożywki LADMAC (przygotowanej zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 1.2) i 5 ml 100-krotnej mieszanki antybiotyków do 500 ml DMEM o wysokiej zawartości glukozy.
nuta: Komórki LADMAC wytwarzają czynnik stymulujący tworzenie kolonii (CSF-1) niezbędny do wspomagania wzrostu komórek MΦ.
- Rozmnażanie komórek w ramach przygotowań do kohodowli
- Aby wysiać komórki MSC i MΦ z zamrożonego materiału, należy zrównoważyć 9 ml odpowiedniej pożywki wzrostowej przygotowanej w sekcji 1.1 w każdej z czterech szalek poddanych działaniu hodowli komórkowych o średnicy 100 mm dla każdego typu komórek i umieścić w inkubatorze do hodowli komórkowych na 15 minut.
- W międzyczasie szybko rozmrozić podwielokrotności10-6 zamrożonych komórek, inkubując je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 2-3 minuty lub do momentu rozmrożenia. Następnie dodać rozmrożone komórki MSC do 9 ml świeżej pożywki wzrostowej MSC i dodać rozmrożone komórki MΦ do 9 ml świeżej pożywki wzrostowej MΦ w sterylnych probówkach stożkowych o pojemności 15 lub 50 ml i odwirować przy 125 x g w wahadłowym wirniku kubełkowym przez 5 minut.
- Odessać lub zdekantować supernatant i ponownie zawiesić każdy granulat w 4 ml odpowiedniej świeżej pożywki, delikatnie pipetując w górę i w dół. Dodać 1 ml zawiesiny komórek do każdej z czterech szalek o średnicy 100 mm dla każdego typu komórek, które zostały zrównoważone w kroku 1.2.1.
- Włóż szalki z komórkami do inkubatora. Zmieniaj podłoże co 2-3 dni, aż do uzyskania 70%-80% zlewu.
2. Nasiona MSC w eksperymentalnych potrawach, Dzień 1
UWAGA: Przed uruchomieniem MSC, zaprojektuj eksperymentalny układ 96-dołkowej płytki do spektrofotometrii fluorescencyjnej oraz szkiełko komorowe do obrazowania dynamicznego. W przypadku płytki 96-dołkowej należy otoczyć dołki doświadczalne studzienkami zawierającymi komórki, ale nie używać ich w teście. Zaznaczyć co najmniej cztery studzienki, które mają być użyte do ślepej próby odczynnika (RBL). Tabela 1 zawiera przykładowy szablon 96-dołkowy, a tabela 2 zawiera przykład szablonu szkiełka 4-dołkowego. Zalecane są czarne lub białe płytki 96-dołkowe z przezroczystym dnem. Optymalna jest prowadnica komorowa ze szkła borokrzemianowego o grubości 1,5 mm, ale liczba komór może być regulowana w zależności od projektu badania. Schemat blokowy podsumowujący poniższe metody znajduje się na rysunku 1.
- Przy zbiegu 70%-80% odessać pożywkę wzrostową z kultur na szalkach o średnicy 100 mm i dodać 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w celu wyizolowania MSC.
- Odessać PBS, dodać 2 ml 0,05% trypsyny/EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy) i umieścić w inkubatorze hodowli na 3-5 minut.
- Po 3 minutach sprawdź odłączenie komórek za pomocą odwróconego mikroskopu. Jeśli komórki są odłączone, przejdź do następnego kroku; Jeśli nie, kontynuuj inkubację przez kolejne 1-2 minuty. Nie inkubować dłużej niż 5-6 minut.
- Dodaj 5 ml świeżej pożywki wzrostowej do naczynia z oderwanymi komórkami. Opłucz naczynie za pomocą mieszaniny trypsyny i pożywki i zbierz komórki do czystej, sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą sterylnej pipety serologicznej.
- Wirować przez 5 minut przy 125 x g. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml świeżej pożywki wzrostowej, delikatnie pipetując w górę i w dół.
- Aby policzyć komórki, dodaj 10 μl zawiesiny komórek do 30 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Następnie odpipetować 10 μl mieszaniny pod szkiełkiem nakrywkowym komory zliczającej hemocytometry.
- Za pomocą mikroskopu odwróconego lub jasnego pola, z obiektywem 10x, policz niebarwione (żywotne) komórki w czterech kwadratach o boku1 mm 2. Oblicz liczbę komórek za pomocą wzoru: komórki/ml = liczba komórek/# 1 mm2 kwadraty x współczynnik rozcieńczenia x 104,
nuta: W tym przykładzie liczba zliczonych kwadratów o rozmiarze 1 mm2 wynosi cztery, a współczynnik rozcieńczenia wynosi 4.
- Użyj równania C1V1 = C2V2, aby obliczyć i przygotować zawiesinę 1 x 105 komórek/ml. Przygotować 1 ml zawiesiny komórki/ml dla każdej kolumny płytki 96-dołkowej, która ma być napełniona, i 0,75 ml dla każdej komory szkiełka 4-dołkowego, która ma być napełniona zgodnie z projektem płytki.
nuta: C1 = liczba komórek, V1 = to, co jest obliczane, C2 = 1 x 105, V2 = 5,50 ml.
- Oznaczyć V1 i odjąć go od pożądanych 5,50 ml całkowitej objętości, aby określić objętość świeżej pożywki potrzebnej do przygotowania zawiesiny. Dodać objętość komórek (V1) z oryginalnej zawiesiny do objętości świeżej pożywki, w sumie 5,50 ml z 1 x 105 komórek/ml.
- Dodać 100 μl zawiesiny 1 x 105 komórek/ml do każdego dołka płytki 96-dołkowej zgodnie z projektem płytki za pomocą wielokanałowego mikropipetora i 530 μl do każdej z studzienek szkiełka komorowego za pomocą mikropipety zgodnie z projektem płytki. Inkubować przez noc.
nuta: W tym eksperymencie MSC są siane w kolumnach 1, 2, 3 i 6 płytki 96-dołkowej (Tabela 1) oraz w dołkach 1 i 2 szkiełka 4-dołkowego (Tabela 2). Dlatego przygotowuje się co najmniej 5,50 ml zawiesiny 1 x 105 komórek/ml. MΦ przy 80% konfluencji jest traktowany mediatorami stanu zapalnego w tym samym dniu, w którym MSCs są wysiewane na płytkach doświadczalnych.
3. Wyizoluj MΦ i przygotuj kokultury, Dzień 2
- Usuń pożywkę aktywacyjną z komórek MΦ i zastąp ją 5 ml świeżej pożywki wzrostowej. Delikatnie zeskrob podnośnikiem do komórek i zbierz komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
- Policz komórki, stosując wykluczenie błękitu trypanowego i hemocytometrię, jak opisano dla MSC w krokach 2.6-2.7.
- Korzystając z równania w krokach 2.8-2.9, przygotuj dwie oddzielne zawiesiny po 2 x 105 komórek/ml, jedną z komórkami z kontrolnej i jedną z komórkami z kultur MΦ poddanych działaniu środka.
nuta: Przygotować 1 ml zawiesiny komórki/ml dla każdej kolumny płytki 96-dołkowej, która ma być napełniona, i 0,75 ml dla każdej komory szkiełka 4-dołkowego, która ma być napełniona zgodnie z projektem płytki.
- Delikatnie odessać pożywkę z dołków doświadczalnych 96-dołkowej płytki zawierającej MSC. Za pomocą mikropipety wielokanałowej dodać 100 μl poddanej działaniu substancji i kontrolnych zawiesin komórek MΦ do odpowiednich studzienek doświadczalnych z MSC i bez MSC, zgodnie ze wzorem płytki. Inkubować przez noc.
- Delikatnie odessać pożywkę z 4-dołkowego szkiełka zawierającego MSC i za pomocą mikropipety dodać 530 μl zawiesiny komórek MΦ do odpowiednich studzienek zgodnie z projektem. Inkubować przez noc.
4. Test fagocytozy, kinetyczny odczyt fluorescencyjnej płytki 96-dołkowej, Dzień 3
- Ustawianie parametrów testu
- W dniu testu należy włączyć czytnik płytek fluorescencyjnych i komputerowo ustawić temperaturę w systemie na 37 °C.
- Otwórz oprogramowanie System Pro i sprawdź ikonę instrumentu w lewym górnym rogu, aby określić, czy instrument jest podłączony do komputera. Jeśli widoczne jest czerwone kółko z linią, kliknij ikonę instrumentu i wybierz instrument w wyskakującym okienku, aby nawiązać połączenie.
- Wybierz opcję Nowy eksperyment, aby uzyskać dostęp do wyskakującego okna Pomocnik konfiguracji płyty. Z menu Plate Set-Up Helper (Pomocnik konfiguracji płyty) wybierz opcję Configure Your Acquisition Settings (Konfiguruj ustawienia pobierania).
- Wybierz Monochromator z menu ustawień konfiguracji optycznej. Wybierz FL (fluorescencja) jako tryb odczytu i Kinetic jako typ odczytu.
- W tym samym oknie konfiguracji, w obszarze Kategoria, kliknij Długości fal, a następnie ustaw szerokości pasma na 9 nm dla wzbudzenia i 15 nm dla emisji.
- Ustaw liczbę par długości fal na 1. Ustaw długości fal LM1 na 510 nm dla wzbudzenia i na 540 nm dla emisji.
- Kontynuuj przeglądanie kategorii i wybierz Typ blachy jako następny. Wybierz opcję odpowiadającą używanemu typowi blachy.
nuta: Ważne jest, aby wybór był zgodny z typem blachy. Wysokości odczytu są ustawiane przez system zgodnie z wyborem.
- Następnie wybierz obszar odczytu i zaznacz obszar płytki 96-dołkowej uwzględnionej w projekcie eksperymentalnym.
- Wybierz PMT i optykę, ustaw wzmocnienie PMT na wysokie i błyski na odczyt na 6. Zaznacz pole obok opcji Czytaj od dołu, jeśli używasz przezroczystej płyty dolnej.
- Wybierz opcję Timing (Czas) i ustaw ją na 10-minutowe interwały w okresie 70 minut.
- Wybierz opcję Potrząśnij, zaznacz pole Przed pierwszym odczytem i ustaw ją na 5 sekund. Zaznacz pole Między odczytami i ustaw je na 3 sekundy. Ustaw intensywność potrząsania zarówno dla opcji Niska, jak i Liniowa.
- Zamknij okno. Gdy pojawi się okno Pomocnik ustawiania blachy, wybierz opcję Konfiguruj układ blachy. Podświetl dołki BL projektu płyty i kliknij Płyta pusta.
- Zaznacz każdy z eksperymentalnych wierszy, kliknij Dodaj, nazwij grupę, a następnie wybierz kolor.
- W obszarze Opcje przypisania poniżej projektu blachy wybierz Seria, a następnie zdefiniuj serię w oknie i kliknij przycisk OK. Powtórz te czynności dla każdej grupy.
- Przygotować zawiesinę zymosanu
- Czekając, aż temperatura systemu osiągnie 37 °C, ponownie zawiesić 1 mg cząstek zymosanu w 5 ml pożywki do obrazowania żywych komórek.
- Dodać 1 ml pożywki do obrazowania żywych komórek do fiolki zawierającej cząstki i zebrać je do szklanej probówki hodowlanej. Przepłukać fiolkę dodatkowym 1 ml roztworu do obrazowania i przenieść ją do tej samej szklanej probówki, aby upewnić się, że wszystkie cząstki zostały przeniesione. Dodać 3 ml dodatkowego roztworu do obrazowania, aby uzyskać 0,2 mg/ml zawiesiny cząstek.
- Wir z szybkimi impulsami przez 30-60 s. Następnie użyj sonikatora z sondą, aby wykonać sonifikację za pomocą 60 szybkich impulsów.
nuta: Bardzo ważne jest, aby stworzyć jednorodną zawiesinę cząstek i nie pozwolić, aby zawiesina pozostawała zbyt długo przed dodaniem do dołków doświadczalnych. Zbrylanie się powtarza się szybko. Gęstość cząstek na komórkę może wymagać optymalizacji w zależności od zastosowanego źródła, obróbki i gęstości MΦ. W prezentowanych badaniach wykorzystano sprzężone cząstki zymozanu. Dostępne są jednak również sprzężone E. coli i S. aureus.
- Dodaj zymosan i odczytaj płytkę
- Odessać pożywkę z dołków doświadczalnych i przepłukać 1x 100 μl roztworu do obrazowania żywych komórek. Przepłucz studzienki RBL roztworem do obrazowania żywych komórek.
- Odessać roztwór do obrazowania żywych komórek z dołków eksperymentalnych i RBL i zastąpić go 100 μl zawiesiny cząstek zymozanu.
- Otwórz tacę na płytki czytnika fluorescencyjnego za pomocą interfejsu panelu dotykowego. Umieść talerz bez pokrywki w tacce z dołkiem A1 w lewym górnym rogu. Zamknij zasobnik za pomocą touchpada i kliknij zielony przycisk Czytaj w górnym menu.
- Po zakończeniu odczytu zapisz plik w odpowiednim folderze i wyeksportuj dane w formacie arkusza kalkulacyjnego, klikając Plik i wybierając Eksportuj.
- Obliczyć średnią ± względną fluorescencję SEM dla każdej grupy kontrprób w każdym punkcie czasowym (10 min, 20 min, 30 min itd.) w arkuszu kalkulacyjnym (plik uzupełniający 1) i przenieść dane do oprogramowania do tworzenia wykresów.
- Użyj formatu wykresu liniowego, aby przedstawić dane i zastosuj dwukierunkową ANOVA (czas x leczenie/MSC jako czynniki), a następnie test wielokrotnych porównań Tukeya w celu określenia różnic między poszczególnymi grupami.
nuta: Podczas odczytywania płytki 96-dołkowej należy przygotować dynamiczną płytkę obrazową do akwizycji obrazu poklatkowego. Upewnij się, że obrazowanie dynamiczne jest kontynuowane z analizą jednego odwiertu doświadczalnego na raz.
Tabela 1: Przykład projektu płytki 96-dołkowej. CBL - Pusta komórka; MSC - rozstawiony dzień 1; MΦ+ zaprawiony i MΦ niepoddany działaniu środka nasiona dzień 2; Ślepa próba odczynnika RBL dodana w 3. dniu testu.
powiedział:
powiedział:
powiedział:
powiedział:
powiedział:
powiedział:
powiedział:
powiedział:
| 1 | cyfra arabska | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| ZA | CBL (Międzynarodowa Sieć T | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL (Międzynarodowa Sieć T | Listy RBL |
| W | CBL (Międzynarodowa Sieć T | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL (Międzynarodowa Sieć T | Listy RBL |
| Z | CBL (Międzynarodowa Sieć T | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL (Międzynarodowa Sieć T | Listy RBL |
| D | CBL (Międzynarodowa Sieć T | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL (Międzynarodowa Sieć T | Listy RBL |
| E | CBL (Międzynarodowa Sieć T | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL (Międzynarodowa Sieć T | Listy RBL |
| Z | CBL (Międzynarodowa Sieć T | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL (Międzynarodowa Sieć T | Listy RBL |
| Z | CBL (Międzynarodowa Sieć T | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL (Międzynarodowa Sieć T | Listy RBL |
| H | CBL (Międzynarodowa Sieć T | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL (Międzynarodowa Sieć T | Listy RBL |
Tabela 2: Przykład projektu szkiełka z 4-dołkową komorą. MSC - platerowany dzień 1; MΦ+ leczone i MΦ nieleczone posiane dzień 2.
powiedział:
| 1 | cyfra arabska | 3 | 4 |
| MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ |
