Wprowadzenie bakteryjnych białek efektorowych do komórek ssaków za pomocą elektroporacji

Streszczenie

Źródło: Sontag, R. L. et al., Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (2015)

W tym filmie pokazujemy wprowadzanie białek efektorowych bakterii do komórek ssaków za pomocą elektroporacji. Wewnątrzkomórkowa lokalizacja bakteryjnych białek efektorowych jest wykrywana za pomocą mikroskopii konfokalnej po barwieniu specyficznymi przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforem.

Protokół

1. Elektroporacja

1. Umieścić 400 μl zawiesiny komórkowej we wstępnie schłodzonej kuwecie i dodać do niej 20 μg wybranego białka (50 μg/ml).
2. Delikatnie przesuń kuwetę ~10 razy, aby wymieszać bez uszkadzania komórek. nuta: Kuwetę można również kilkakrotnie odwrócić, aby dokładnie wymieszać, ale nie pipetuj w górę iw dół ani nie wiruj, aby uniknąć uszkodzenia komórek.
3. Osusz zewnętrzną część kuwety ręcznikiem papierowym lub inną wycieraczką, aby uniknąć wyładowania łukowego w elektroporatorze.
4. Elektroporacja próbki przy napięciu 0,3 kV przez 1,5-1,7 ms. Uwaga: Było to typowe dla tego badania.
5. Natychmiast po elektroporacji delikatnie przetrząśnij kuwetą ~10 razy, aby dokładnie wymieszać.

2. Poszycie komórek

1. Przechowuj kuwetę z elektroporowanymi ogniwami na lodzie, aż będzie gotowa do umieszczenia na płytkach regeneracyjnych.
2. W przypadku większości dalszych analiz należy przemyć komórki 1x wstępnie podgrzanym NGM, aby usunąć obce białko efektorowe.
   1. Usunąć komórki do analizy i zawiesić w 3-5 ml NGM.
   2. Komórki osadu przez odwirowanie przy 900 x g przez 4 min.
   3. Zawiesić w odpowiedniej objętości NGM dla żądanego rozmiaru płytki (np. 2 ml dla naczynia 35 mm).
3. Usuń odpowiednią ilość komórek do dalszej analizy.
   1. Przykład 1: Płytka do naczyń ze szklanym dnem do analizy mikroskopowej.
   2. Przykład 2: Płytka w plastiku hodowli komórkowej w celu analizy białek, takiej jak oczyszczanie powinowactwa.
4. Pozwól komórkom odzyskać siły na zrównoważonych płytkach w nawilżonej atmosferze 95% powietrza/5% CO₂ w temperaturze 37 ° C przez co najmniej 4 godziny.

3. Analiza mikroskopowa

1. Barwienie fiksacyjne/immunofluorescencyjne
   1. Umyj komórki 1x sterylnym PBS po 4-godzinnym okresie rekonwalescencji.
   2. Utrwal komórki w 100% metanolu przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Użyj wystarczającej ilości metanolu, aby całkowicie pokryć komórki (np. 2 ml na szalkę 35 mm).
   3. Umyć 3x sterylnym PBS.
   4. Przepuszczalność komórek za pomocą 0,4% Triton X-100 w PBS przez 15 min. Na przykład użyj 1 ml na płytkę o średnicy 35 mm.
      1. Dostosuj długość przepuszczalności i siłę Triton X-100 w zależności od epitopu i lokalizacji docelowego białka. nuta: Najlepsze wyniki będą musiały zostać empirycznie określone dla każdego celu, jednak powyższe warunki powinny być odpowiednie dla większości celów cytozolowych.
   5. Blok z 5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w PBS przez 1 godzinę w RT. Na przykład użyj 1 ml na płytkę o średnicy 35 mm.
   6. Umyj 3x PBS.
   7. Inkubować przeciwciało pierwszorzędowe w roztworze wiążącym przeciwciała (0,1% Triton X-100 i 1% BSA w PBS) przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie kołysząc. Na przykład użyj 0,5 ml na płytkę o średnicy 35 mm.
      1. Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi rozcieńczania przeciwciał. nuta: Na przykład przeciwciało peptydowe wiążące streptawidynę (SBP-tag) zastosowano w rozcieńczeniu 1:1,000, podczas gdy przeciwciało PKN1 zastosowano w rozcieńczeniu 1:200.
   8. Umyć 4x PBS.
   9. Inkubować z odpowiednim fluorescencyjnie sprzężonym przeciwciałem drugorzędowym w roztworze wiążącym przeciwciała przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
      1. Na przykład używaj Alexa 488 lub Alexa 647 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
         1. Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi rozcieńczania przeciwciał. (np. około 1:1,000 w tym badaniu).
      2. W razie potrzeby dodaj inne plamy, na przykład 5 μM aglutyniny z kiełków pszenicy (WGA) sprzężonej z Alexa 647 lub DAPI zgodnie z zaleceniami producenta, przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   10. Umyć 5x PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem do momentu przygotowania do obrazu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,25% roztwór trypsyny-EDTA	Komórka	25-050-CL
0,4 cm Jednorazowe kuwety do elektroporacji	Bio-Rad	165-2088
100% metanol	jakikolwiek	N/a	Łatwopalny, toksyczny
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	Nr kat. A4919
Aparatura do liczenia komórek - hemocytometr lub licznik redlic	Beckman Coulter	Wzór Z1
Inkubator do hodowli komórkowych	jakikolwiek	N/a	Nawilżone 95% powietrze/5% CO2 atmosfera o temperaturze 37 °C
Plastik do hodowli komórkowych	jakikolwiek	N/a	Kolby/płytki do hodowli komórkowych, pipety, probówki, gumowe policjantki
Modyfikacja Dulbecco Eagle's Medium (DMEM)	Komórka	10-013	Ciepło do 37 °C
Elektroporator	Bio-Rad	Pulser E. coli
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Komórka	35-016-CV
Fluorescencyjny mikroskop konfokalny	Ziess powiedział:	modelu LSM 710
Naczynia ze szklanym dnem do mikroskopii	Wilco Wells	HBSt-3522
Linia komórkowa HeLa	Kontroler ATCC (Kontroler T	Kontroler ATCC CCL-2
Minimalna pożywka niezbędna (MEM)	Komórka	10-010	Ciepło do 37 °C
Inne barwniki fluorescencyjne (WGA, DAPI) w połączeniu z odczynnikiem zapobiegającym blaknięciu	jakikolwiek	N/a
Penicylina/Streptomycyna	Komórka	30-002-CL
RAW 264.7 Linia komórkowa	Kontroler ATCC (Kontroler T	TIB-71
Pierwszorzędowe przeciwciało przeciwko obiektowi zainteresowania	jakikolwiek	N/a
Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem	jakikolwiek	N/a
sól fizjologiczna buforowana fosforanami	jakikolwiek	N/a	Schłodzić do 4 °C
Sterylny sól fizjologiczna buforowana fosforanami	jakikolwiek	N/a	Ciepło do 37 °C
Wirówka stołowa zdolna do przyjmowania stożkowych probówek (preferowane wiadro wahadłowe)	jakikolwiek	N/a
Tryton X-100	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T8585	Drażniące, Toksyczne