Wprowadzenie bakteryjnych białek efektorowych do komórek ssaków za pomocą elektroporacji

Streszczenie

Źródło: Sontag, R. L. et al., Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (2015)

W tym filmie pokazujemy wprowadzanie białek efektorowych bakterii do komórek ssaków za pomocą elektroporacji. Wewnątrzkomórkowa lokalizacja bakteryjnych białek efektorowych jest wykrywana za pomocą mikroskopii konfokalnej po barwieniu specyficznymi przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforem.

Protokół

1. Elektroporacja

1. Umieścić 400 μl zawiesiny komórkowej we wstępnie schłodzonej kuwecie i dodać do niej 20 μg wybranego białka (50 μg/ml).
2. Delikatnie przesuń kuwetę ~10 razy, aby wymieszać bez uszkadzania komórek. nuta: Kuwetę można również kilkakrotnie odwrócić, aby dokładnie wymieszać, ale nie pipetuj w górę iw dół ani nie wiruj, aby uniknąć uszkodzenia komórek.
3. Osusz zewnętrzną część kuwety ręcznikiem papierowym lub inną wycieraczką, aby uniknąć wyładowania łukowego w elektroporatorze.
4. Elektroporacja próbki przy napięciu 0,3 kV przez 1,5-1,7 ms. Uwaga: Było to typowe dla teg....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,25% roztwór trypsyny-EDTA	Komórka	25-050-CL
0,4 cm Jednorazowe kuwety do elektroporacji	Bio-Rad	165-2088
100% metanol	jakikolwiek	N/a	Łatwopalny, toksyczny
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	Nr kat. A4919
Aparatura do liczenia komórek - hemocytometr lub licznik redlic	Beckman Coulter	Wzór Z1
Inkubator do hodowli komórkowych	jakikolwiek	N/a	Nawilżone 95% powietrze/5% CO2 atmosfera o temperaturze 37 °C
Plastik do hodowli komórkowych	jakikolwiek	N/a	Kolby/płytki do hodowli komórkowych, pipety, probówki, gumowe policjantki
Modyfikacja Dulbecco Eagle's Medium (DMEM)	Komórka	10-013	Ciepło do 37 °C
Elektroporator	Bio-Rad	Pulser E. coli
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Komórka	35-016-CV
Fluorescencyjny mikroskop konfokalny	Ziess powiedział:	modelu LSM 710
Naczynia ze szklanym dnem do mikroskopii	Wilco Wells	HBSt-3522
Linia komórkowa HeLa	Kontroler ATCC (Kontroler T	Kontroler ATCC CCL-2
Minimalna pożywka niezbędna (MEM)	Komórka	10-010	Ciepło do 37 °C
Inne barwniki fluorescencyjne (WGA, DAPI) w połączeniu z odczynnikiem zapobiegającym blaknięciu	jakikolwiek	N/a
Penicylina/Streptomycyna	Komórka	30-002-CL
RAW 264.7 Linia komórkowa	Kontroler ATCC (Kontroler T	TIB-71
Pierwszorzędowe przeciwciało przeciwko obiektowi zainteresowania	jakikolwiek	N/a
Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem	jakikolwiek	N/a
sól fizjologiczna buforowana fosforanami	jakikolwiek	N/a	Schłodzić do 4 °C
Sterylny sól fizjologiczna buforowana fosforanami	jakikolwiek	N/a	Ciepło do 37 °C
Wirówka stołowa zdolna do przyjmowania stożkowych probówek (preferowane wiadro wahadłowe)	jakikolwiek	N/a
Tryton X-100	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T8585	Drażniące, Toksyczne