Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Uprawa Malassezia w warunkach laboratoryjnych
UWAGA: Przechowuj wszystkie odczynniki i media używane do tego protokołu w temperaturze pokojowej (RT, 20 – 25 °C), chyba że zaznaczono inaczej, ponieważ niższa temperatura może hamować rozwój grzybów.
- Przygotuj modyfikowaną płynem pożywkę Dixon (mDixon) do wzrostu Malassezia. Aby przygotować 500 ml płynnej pożywki mDixon, rozpuść 18 g ekstraktu słodowego, 10 g suszonej żółci wołowej, 5 ml Tween-40, 3 g peptonu, 1 ml glicerolu i 1 ml kwasu oleinowego w 500 ml destylowanego H2O (dH2O). Dostosuj pożywkę do pH 6 za pomocą HCl i autoklawu. Przechowywać podłoże w temperaturze pokojowej.
- Przygotuj płytki agarowe mDixon, dodając 7,5 g agaru do 500 ml pożywki mDixon przed autoklawowaniem. Powoli schłodzić agar mDixon po autoklawowaniu za pomocą drążka kierowniczego i magnetycznej płyty grzewczej, aby uniknąć częściowego zestalenia pożywki podczas schładzania.
- Gdy agar ostygnie do 50 – 60 °C, przelej płyn na szalki Petriego w okapie z przepływem laminarnym i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez noc.
nuta: Płytki agarowe mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni, jeśli są owinięte i trzymane do góry nogami, aby uniknąć parowania.
- Uzyskać izolaty Malassezia i ożywić liofilizowane stada Malassezia zgodnie z instrukcjami uzyskanymi przez dostawcę.
- Zaszczepić 10 ml płynnej pożywki mDixona w sterylnej kolbie Erlenmeyera o pojemności 100 ml z ożywioną zawiesiną Malassezia zgodnie z instrukcjami otrzymanymi przez dostawcę. Inkubować kulturę w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C i 180 obr./min.
- Regularnie sprawdzaj wzrost kultury Malassezia, sprawdzając wygląd kremowego koloru i zmętnienia. Kinetyka wzrostu zależy od gatunku i szczepu Malassezia i może być szczególnie powolna, gdy Malassezia jest świeżo ożywiona z liofilizowanego bulionu. (Rysunek 1A).
- Przygotuj wywar glicerolowy, mieszając 3 części gęsto rosnącej kultury Malassezia w pożywce mDixon z 1 częścią sterylnego 99% glicerolu. Mieszaninę Malassezia/glicerol rozmieścić w sterylnych probówkach z nakrętką i przechowywać w temperaturze -80 °C.
- Do rozmnażania in vitro, należy rozlać Malassezia na płytkę Malassezia z płynnej kultury w mDixon lub z zamrożonego bulionu glicerolowego na płytkę agarową mDixon (doprowadzoną do temperatury suchej z 4 °C) za pomocą pętli inokulacyjnej.
nuta: Przed użyciem przenieść płytki agarowe mDixon do RT z 4 °C, ponieważ zimny agar mDixon hamuje rozwój grzybów.
- Inkubować płytkę (płytki) agarowe z Malassezia do góry nogami w inkubatorze aN (niewstrząsającym) w temperaturze 30 °C. Regularnie sprawdzaj wzrost kolonii Malassezia.
UWAGA: Kolonie Malassezia na płytkach agarowych mDixon pojawiają się w ciągu 3 - 5 dni i są kremowo-matowe i gładkie z wypukłym uniesieniem (ryc. 1B).
- Przechowuj kolonie Malassezia na płytkach agarowych mDixon w temperaturze pokojowej przez ~ 2 tygodnie. Następnie przygotować nową płytkę agarową mDixon, rozpylając Malassezia z zamrożonego bulionu glicerynowego, jak opisano w ppkt 1.7.
2. Przygotowanie inokulum do eksperymentalnego zakażenia myszy Malassezia
- Zaszczepić 10 ml płynnej pożywki mDixona w sterylnej kolbie Erlenmeyera o pojemności 100 ml z 3 - 5 pojedynczymi koloniami Malassezia z płytki agarowej mDixona (patrz krok 1, Rysunek 1B).
- Inkubować kulturę Malassezia przez ~ 48 do 96 godzin w temperaturze 30 °C i 180 obr./min, aż kultura stanie się kremowa i mętna (ryc. 1A).
nuta: Czas niezbędny do wzrostu Malassezia zależy od gatunku i szczepu Malassezia oraz ilości grzyba użytego do zaszczepienia.
- Przenieść 2 ml kultury Malassezia do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml i wirować przez 1 minutę przy 10 000 x g.
- Wyrzucić supernatant i przemyć osad, zawieszając go w 1 ml roztworu soli buforowanej fosforanem (PBS). Ponownie odwirować przez 1 minutę przy 10 000 x g.
- Po przepłukaniu zawiesić osad w 1 ml PBS przez energiczne pipetowanie i zmierzyć gęstość optyczną roztworu przy 600 nm (ODA600) za pomocą spektrometru. Rozcieńczyć zawiesinę Malassezia 20 – 50 x PBS do pomiaru OD, aby upewnić się, że odczyt wynosi od 0,1 do 1,
nuta: Gęstość 3-dniowej hodowli Malassezia na ogół waha się od 15 do 30 ODA600, w zależności od gatunku i szczepu Malassezia oraz od liczby komórek drożdży użytych do inokulacji kultury (etap 2.1). Malassezia ma tendencję do tworzenia agregatów, dlatego konieczne jest energiczne pipetowanie w celu zapewnienia jednorodności zawiesiny.
- Podać objętość zawiesiny Malassezia w PBS, która odpowiada gęstości 4 ODA600, do sterylnej probówki o pojemności 2 ml. Przygotować 1 probówkę na zwierzę, które ma być zakażone.
- Odwirować probówki zawierające Malassezia przez 1 minutę w temperaturze 10 000 x g.
- Odrzucić supernatant i zawiesić osad Malassezia w 200 μl rodzimej oliwy z oliwek (co odpowiada 2 komórkom drożdżyA600 OD / 100 μl oliwy z oliwek).
nuta: Stwierdzono, że oliwa z oliwek jest dobrym nośnikiem do zakażenia naskórnego Malassezia, ponieważ Malassezia jest drożdżami lipofilowymi i zależnymi od lipidów. Oliwa z oliwek jest lepiej wchłaniana przez skórę niż PBS. Należy jednak pamiętać, że nie jest łatwo zawiesić Malassezię w oliwie z oliwek. Popraw zawiesinę Malassezia/oliwy z oliwek poprzez wirowanie. Zawiesinę należy utrzymywać w temperaturze pokojowej do czasu jej wykorzystania w celu zakażenia.
- Przygotuj probówki z samą oliwą z oliwek do pozorowanego zakażenia zwierząt kontrolnych.
3. Zarażanie myszy Malassezia
- Zamów samice myszy C57BL/6 w wieku 6-8 tygodni i pozwól im zaaklimatyzować się w obiekcie dla zwierząt doświadczalnych przez co najmniej tydzień. Oblicz dla 3-5 myszy na grupę, w tym niezakażoną grupę kontrolną.
- Przygotuj sterylny koktajl znieczulający zawierający 1,3 mg/ml ksylazyny i 6,5 mg/ml ketaminy w PBS. 5 ml koktajlu znieczulającego wystarcza do znieczulenia 20 zwierząt. Dostosuj objętość koktajlu w zależności od liczby zwierząt, które mają być znieczulone.
- Znieczulić zwierzęta, wstrzykując dootrzewnowo 10 μl/g koktajlu znieczulającego (co odpowiada 65 mg ketaminy i 13 mg ksylazyny na kg masy ciała) i umieścić znieczulone zwierzęta na poduszce grzewczej w temperaturze 37 °C.
nuta: Przy wskazanej dawce zwierzęta zwykle pozostają znieczulone przez ~ 30 - 60 min.
- Sprawdź odruchy, ściskając tylną stopę kleszczami, aby upewnić się, że zwierzęta są w pełni znieczulone.
- Nałóż krem pod oczy na oczy, aby zapobiec odwodnieniu podczas znieczulenia.
- Opcjonalnie zmierz grubość ucha w obu uszach za pomocą suwmiarki (zakres 0 - 5 mm). Zmierz dwa różne obszary każdego ucha i oblicz średnią grubość ucha na ucho.
nuta: Pomiar grubości ucha jest opcjonalny i zależy od pytania badawczego. Jeśli jednak grubość ucha jest używana jako odczyt stanu zapalnego skóry, konieczne jest zmierzenie podstawowej grubości ucha przed infekcją. (patrz krok 4).
- Opcjonalnie należy przerwać barierę naskórkową skóry ucha grzbietowego poprzez łagodne zdzieranie taśmy: ręcznie nałóż mały kawałek taśmy na skórę i usuń go ponownie. Powtórz przez 5 kolejnych rund, używając świeżego kawałka taśmy dla każdej rundy.
UWAGA: Malassezia wywołuje bardziej wyraźny stan zapalny skóry w skórze zaburzonej barierowo w porównaniu ze skórą niezakłóconą (ryc. 2A).
- Nanieść miejscowo 100 μl (2 ODA600) zawiesiny Malassezia/oliwy z oliwek na grzbietową stronę każdego ucha za pomocą sterylnej pipety. Należy uwzględnić grupę kontrolną zwierząt, które są poddawane wyłącznie działaniu oliwy z oliwek (grupa kontrolna traktowana podłożem).
nuta: Bezpośrednio przed aplikacją energicznie rozmieszać zawiesinę Malassezia/oliwę z oliwek, aby uzyskać jednorodną zawiesinę Malassezia.
- Pozostaw znieczulone zwierzęta na poduszce grzewczej, aby uniknąć hipotermii, dopóki nie wykażą oznak powrotu do zdrowia (ruch wąsów, przyspieszone oddychanie itp.).
- Wstrzyknąć podskórnie 200 μl sterylnego i podgrzanego 2% roztworu glukozy do fałdu karkowego, aby wspomóc jego metabolizm i nawodnienie.
nuta: Aby przygotować sterylny 2% roztwór glukozy, rozpuść 1 mg glukozy w 50 ml PBS i przefiltruj go za pomocą filtra 0,2 μm. Roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Przenieś zwierzęta z powrotem do ich klatki.
4. Analiza zapalenia skóry wywołanego przez Malassezia
UWAGA: Ta procedura opisuje analizę obrzęku ucha wywołanego przez Malassezia podczas infekcji, który służy jako parametr stanu zapalnego skóry. Warunkiem wstępnym do analizy obrzęku ucha wywołanego przez grzyby jest zmierzenie wyjściowej grubości ucha przed usunięciem taśmy i/lub infekcją (krok 3.5).
- Przygotować komorę izofulanową do krótkotrwałego znieczulenia zwierząt zakażonych Malassezią i kontrolnych.
- Przenoś jedno zwierzę na raz do komory i poczekaj, aż zwierzę zostanie w pełni znieczulone.
nuta: Oznaki prawidłowego znieczulenia obejmują całkowite rozluźnienie ciała, a także powolny i ciężki (boczny) oddech. Uważnie monitoruj znieczulenie, ponieważ długotrwałe narażenie na izofluran może być śmiertelne.
- Wyjmij zwierzę z komory i umieść je na chusteczce.
- Zmierz grubość ucha (uszu) za pomocą suwmiarki (zakres 0 - 5 mm). Zmierz dwa różne obszary każdego ucha i oblicz średnią grubość na ucho (patrz krok 3.5).
- Przenieś zwierzę z powrotem do klatki.
nuta: Znieczulenie izofluranem jest bardzo krótkotrwałe, a zwierzęta wracają do zdrowia w ciągu ~ 30 s po wyjęciu z komory izofluranu.
- Oblicz wzrost grubości ucha, odejmując średnią wyjściową grubość ucha, zmierzoną przed usunięciem taśmy i/lub zakażeniem, od średniej grubości ucha mierzonej w każdym punkcie czasowym po zakażeniu.
- Wykreślić obliczone wartości jako wzrost grubości ucha lub, alternatywnie, jako całkowitą grubość ucha w czasie dla każdego zwierzęcia lub grupy zwierząt (rysunek 2B).
5. Analiza obciążenia grzybami w zakażonej skórze
- Przygotuj sterylną probówkę do mikrowirówek o pojemności 2 ml dla każdego ucha, które ma zostać pobrane, zawierającą 0,5 ml sterylnego 0,05% nonidetu P40 (NP40) wdH2Oi autoklawowaną stalową kulkę (średnica 5 mm).
- Zważ probówki za pomocą wagi precyzyjnej i zapisz dokładną masę.
- Poddać myszy eutanazji przez uduszenie CO2 .
- Wyjąć uszy u podstawy i przenieść do probówki zawierającej 0,5 ml sterylnego 0,05% NP40 w dH2O, zgodnie z opisem w krokach 5.1 - 5.2.
- Zważyć rurkę zawierającą tkankę ucha i obliczyć rzeczywistą masę każdej próbki, odejmując masę rurki bez narządu od masy rurki z narządem.
- Homogenizować tkankę ucha przez 6 minut przy 25 Hz za pomocą homogenizatora tkankowego. Upewnij się, że tkanka jest dobrze zhomogenizowana.
- Umieścić 100 μl każdej próbki (co odpowiada 1/5 każdego homogenatu, współczynnik rozcieńczenia = 5) na płytkach agarowych mDixon i inkubować płytki do góry nogami w inkubatorze o temperaturze 30°C.
nuta: Ilość posiewu homogenatu należy dostosować do spodziewanego obciążenia grzybami. Upewnij się, że na płytce znajduje się wystarczająca ilość homogenatu, aby uzyskać co najmniej 10 i nie więcej niż 250 kolonii na płytkę, aby umożliwić łatwe wyliczenie. Opcjonalnie należy ułożyć na próbkę wiele płytek o różnych rozcieńczeniach homogenatu.
- Regularnie sprawdzaj wzrost kolonii Malassezia.
nuta: Kolonie stają się widoczne zwykle po 2 - 3 dniach. Czas potrzebny do wzrostu kolonii Malassezia zależy od gatunku i szczepu Malassezia.
- Policz kolonie na talerzu.
- Oblicz liczbę jednostek tworzących kolonie, jtk / g tkanki, używając następującego wzoru:
jtk/g tkanki = (liczba kolonii/płytka) x (współczynnik rozcieńczenia) / (masa próbki skóry w g).
nuta: Przybliżoną minimalną granicę wykrywalności można ocenić za pomocą następującego wzoru: minimalna granica wykrywalności = (1 kolonia/płytka) x (współczynnik rozcieńczenia) / (średnia masa wszystkich próbek skóry w g).
- Obciążenia grzybami są zwykle wykreślane w skali logarytmicznej (rysunek 2C).
