$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Zakażenie Mtb komórek pochodzących z monocytów
UWAGA: Następujące kroki muszą być wykonane w obiekcie BSL-3.
- Zawiesić osad Mycobacterium tuberculosis (Mtb) w pożywce RPMI bez surowicy w nowej sterylnej probówce o pojemności 50 ml i dostosować końcowe stężenie bakterii do około 5 x 106 CFU/ml.
- Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z 6-dołkowej płytki (płytek) zawierających komórki pochodzące z monocytów. Dodaj 1 ml pożywki RPMI bez surowicy do każdego dołka. Dodać 1 ml zawiesiny bakteryjnej na studzienkę, aby uzyskać wielokrotność infekcji (MOI) 5:1, tj. 5 x 106 CFU na 10-6 makrofagów w 2 ml / basenie i inkubować płytki przez 4 godziny w temperaturze 37°C i 5% CO2 .
- Po zakażeniu przemyj komórki 3 razy 1 ml sterylnego buforu do płukania, aby usunąć bakterie zewnątrzkomórkowe. Przechyl płytę i ostrożnie wyjmij cały bufor myjący z rogów. Ponownie zawiesić zakażone Mtb komórki pochodzące z monocytów w 2 ml kompletnej pożywki RPMI bez antybiotyków i przystąpić do barwienia cytometrią przepływową lub inkubować komórki przez kolejne 24 godziny (lub inne punkty czasowe) przed cytometrią przepływową.