Test do badania roli witronektyny w przyleganiu bakterii do komórek nabłonka gospodarza

Streszczenie

Źródło: Singh, B. et al., Testy do badania roli witronektyny w adhezji bakteryjnej i odporności surowicy. J. Vis. Exp. (2018)

W tym filmie demonstrujemy test do badania roli witronektyny w przyleganiu Haemophilus influenzae do komórek nabłonka gospodarza.

Protokół

1. Badanie zależnego od Vn przylegania bakterii do komórek nabłonkowych

1. Hodowla komórek A549 (komórki nabłonka pęcherzyków płucnych typu II) w kolbie do hodowli tkankowej o długości 75^cm2 z pożywką F12 uzupełnioną 10% (obj./obj.) płodową surowicą cielęcą (FCS) (kompletna pożywka) i 5 μg/ml gentamycyny. Inkubować kolbę w inkubatorze z 5% CO₂ w temperaturze 37 °C przez 3 dni, aż do uzyskania 80% konfluencji (konfluencję można oszacować, wizualizując pokrycie powierzchni przez komórki za pomocą mikroskopu odwróconego). Poniższe cztery kroki opisują, jak przygotować komórki nabłonkowe do testu.
   1. Przemyć monowarstwę komórek w kolbie dwukrotnie 20 ml PBS, delikatnie obracając. Aby oderwać komórki od powierzchni kolby, dodać 2 ml roztworu enzymu oddzielającego komórki i inkubować kolbę przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Postukać w kolbę dłonią, aby oderwać wszystkie komórki od plastikowej powierzchni. Pipetuj kilka razy w górę i w dół, aby rozproszyć grudki komórek.
   2. Dodać 18 ml kompletnej pożywki F12 do kolby i przenieść całą zawiesinę komórek do sterylnej probówki Falcon o pojemności 50 ml. Odwirować zawiesinę komórkową przez 5 minut przy 200 x g w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 10 ml kompletnej pożywki F12.
   3. Usunąć 10 μl zawiesiny komórek i umieścić ją w probówce Eppendorfa, a następnie dodać 90 μl roztworu błękitu trypanowego. Załadować próbkę do hemocytometru (głębokość 0,1 mm) po umieszczeniu szkiełka nakrywkowego.
   4. Policz wszystkie żywe komórki w obszarach A, B, C i D (każde pole składa się z 16 kwadratów, a każdy kwadrat ma powierzchnię 0,0025 mm²), a następnie oblicz średnią liczbę komórek ([A+B+C+D]/4). Oblicz liczbę komórek na mililitr, korzystając z następującego równania:
      Komórki żywotne/ml = średnia liczba komórek × 10⁴ × współczynnik rozcieńczenia.
      nuta: Tutaj współczynnik rozcieńczenia wynosi 10.
   5. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową do 5,0 x 10³ komórek/ml za pomocą kompletnej pożywki zawierającej 5 μg/ml gentamycyny. Dozować 500 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli komórek. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w 5% CO_{2 aż} do 90% zlewania się komórek.
2. Przed zakażeniem bakteryjnym należy usunąć pożywkę z dołków i dodać pożywkę F12 (bez FCS), a następnie inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
3. Przemyć monowarstwę komórek trzykrotnie 500 μl PBS w temperaturze pokojowej temperatury. Umieścić płytkę na lodzie i dodać 100 μl wstępnie schłodzonej pożywki F12 zawierającej 10 μg/ml Vn. Inkubować płytkę w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę. W przypadku studzienek kontrolnych dodaj tylko pożywkę F12.
4. Po inkubacji odrzucić roztwór, pipetując i dwukrotnie przemyć warstwę komórkową 1 ml PBS w temperaturze pokojowej.
5. Kultura Hif izoluje klinicznie w pożywce do infuzji mózgowo-sercowej (BHI) uzupełnionej 10 μg/ml NAD i heminą w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min. Użyj pożywki Luria-Bertani do hodowli E. coli. Zebrać Hif w środkowej fazie logarytmicznej (OD600 = 0,3) i ponownie zawiesić bakterie w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), pH 7,2, zawierającej 1% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (bufor blokujący; PBS-BSA). Dostosować zawiesinę do 10⁹ jtk/ml. Zawiesić kulturę świeżo wyhodowanego Hif M10 w pożywce F12 (2×10⁸ jtk/ml). Dodać 100 μl tej zawiesiny bakteryjnej do każdej studzienki i inkubować płytkę przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
   nuta: Każda studzienka zawiera około 2 x 10⁵ komórek A549. W przypadku infekcji dodano 2 x 10⁷ bakteryjnych CFU, co odpowiada wielokrotności infekcji wynoszącej 100.
6. Usunąć pożywkę przez pipetowanie i trzykrotnie przemyć komórki nabłonkowe A549 PBS. Dodać 50 μl/basenik roztworu oddzielającego komórki i inkubować płytkę przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
7. Następnie dodaj 50 μl kompletnej pożywki F12 do dołka, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną. Przenieść komórki nabłonkowe (≈100 μl [tj. całą objętość]) z każdej studzienki do szklanej probówki o pojemności 6 ml zawierającej cztery szklane kulki. Lizuj komórki w temperaturze pokojowej, wirując przez 2 minuty.
8. Rozcieńczyć 10 μl lizatu komórkowego 100-krotnie, dodając 10 μl lizatu do 990 μl pożywki F12. Umieścić 10 μl rozcieńczonej próbki na płytce z agarem czekoladowym.
9. Inkubować płytkę z agarem czekoladowym w temperaturze 37 °C przez noc, a następnie policzyć kolonie. Każda kolonia reprezentuje jedną jtk.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
5 ml probówka okrągłodenna z polistyrenu	BD Sokół	Nr kat. 60819-138	12 × styl 75 mm
Inkubator zasilany 5% CO2	Thermo Scientific	BBD6220
6 ml probówka okrągłodenna z polistyrenu	Firma VWR	89000-478	12 × 75 mm z zaślepką
Płytki 24-dołkowe	BD Sokół	08-772-1H	Klasa hodowli komórkowej
75 cm2 kolba do hodowli tkanek	BD Sokół	BD353136	Wentylowane
A549 Linia komórkowa człowieka	Sigma-Aldrich	86012804-1VL
Enzym odrywający komórki (Accutase)	Sigma-Aldrich	A6964-500ML	Klasa kultury komórkowej
Albuminy surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	Certyfikat A2058	Nadaje się do hodowli komórkowych
F12 średni	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D6421	Klasa kultury komórkowej
Surowica cielęca płodu (FCS)	Sigma-Aldrich	12003C	Nadaje się do hodowli komórkowych
Hemocytometr	Lotnisko Marienfeld	Numer katalogowy: 640210
Kolba do hodowli tkankowych	BD Sokół	3175167	75 cm2
Witronektyna (Vn) z osocza ludzkiego	Sigma-Aldrich	V8379-50UG	Klasa hodowli komórkowej