Określenie roli witronektyny w oporności bakterii na działanie bakteriobójcze surowicy ludzkiej

Streszczenie

Źródło: Singh, B. et al., Testy do badania roli witronektyny w adhezji bakteryjnej i odporności surowicy.J. Vis. Exp.(2018)

Ten film pokazuje rolę witronektyny, ludzkiej glikoproteiny surowicy, na odporność bakterii. Przeciwciała w surowicy oddziałują z białkami powierzchniowymi bakterii, aktywując białka dopełniacza i tworząc kompleks ataku błonowego, powodując lizę komórek bakteryjnych. Wiązanie witronektyny z białkiem błony bakteryjnej zapobiega tworzeniu się kompleksu ataku błony, co skutkuje przeżyciem bakterii.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Analiza zależnej od Vn odporności na bakteriobójcze działanie ludzkiej surowicy

1. Kup normalną ludzką surowicę (NHS) ze źródła komercyjnego. Przygotować witronektynę lub surowicę zubożoną w Vn (VDS). Uzupełnij VDS o 180 nM Vn, co odpowiada Vn obecnemu w NHS.
2. Przygotować surowicę inaktywowaną termicznie (HIS) poprzez ogrzewanie NHS w temperaturze 56 °C przez 30 minut w celu inaktywacji białek dopełniacza.
   nuta: Optymalne stężenie w surowicy (5%) i czas inkubacji (15 min) dla testu określono empirycznie dla Haemophilus influenzae typu f (Hif); Parametry te mogą się różnić w przypadku innych patogenów bakteryjnych.
3. Hodowla bakterii (w tym przypadku Hif M10 i zmutowany Hif M10Δlph) do środkowej fazy logarytmicznej (OD₆₀₀ = 0,3). Bakterie osadkowe przez odwirowanie w stężeniu 3.500 x g przez 10 min.
4. Zawiesić osad bakteryjny z 1 objętością żelatyny dekstrozowej Bufor weronalny (DGVB⁺⁺; pH 7,3) zawierający 2,5% (w/v) glukozy, 2 mM chlorek magnezu, MgCl₂, 0,15 mM chlorek wapnia, CaCl₂ i 0,1% (wag./obj.) żelatynę.
5. Dodaj 1,5 x 10³ jednostki tworzące kolonię (CFU) bakterii do 100 μl DGVB⁺⁺ zawierającego 5% surowicy (NHS, HIS, VDS lub VDS+180 nM Vn). Inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 15 minut, wytrząsając przy 300 obr./min.
6. Usunąć 10 μl podwielokrotności z mieszaniny reakcyjnej po 0 min (próbka T₀) i 15 min (T_t próbka) i ułożyć na płytce na agarze czekoladowym. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez noc.
7. Po inkubacji policz kolonie pojawiające się na talerzu. Obliczyć procent zabitych bakterii, korzystając z następującego równania: (jednostka tworząca kolonię lub jtk przy T_t)/(jtk przy T₀) × 100.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
6 ml probówka okrągłodenna z polistyrenu	Firma VWR	89000-478	12 × 75 mm z zaślepką
Normalna surowica ludzka (NHS)	Complement Technology, Inc.	Nhs	Zbiorcza surowica ludzka
Chlorek wapnia (CaCl2)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C5670-500G
glukoza	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
żelatyna	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał G9391	Nadaje się do hodowli komórkowych
Hemocytometr	Lotnisko Marienfeld	Numer katalogowy: 640210
Chlorek magnezu (MgCl2)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M8266-1KG
Witronektyna (Vn) z osocza ludzkiego	Sigma-Aldrich	V8379-50UG	Klasa hodowli komórkowej
Shakerze bostońskim	Stuart Naukowy	Zobacz materiał STR6	Wytrząsarka platformy