Model zakażenia błony śluzowej szyjki macicy u człowieka do badania patogenezy HIV w warunkach ex vivo

Streszczenie

Źródło: Introini, A., et al., Ex vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film pokazuje ex vivo zakażenie ludzkiej tkanki błony śluzowej macicy ludzkim wirusem niedoboru odporności typu 1, HIV-1, oraz ich utrzymanie na gąbkach żelatynowych na granicy powietrze-ciecz. Metoda ta pozwala na monitorowanie replikacji i patogenezy HIV-1 w tkankach ludzkich.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.

1. Rozwarstwienie i zakażenie błony śluzowej szyjki macicy

UWAGA: Dla uzyskania optymalnych wyników, eksplantaty błon śluzowych szyjki macicy powinny być przetworzone i zakażone jak najszybciej po operacji, najlepiej w tym samym dniu operacji. Alternatywnie, próbki mogą być przechowywane zanurzone w pożywkach hodowlanych uzupełnionych antybiotykami w temperaturze 4°C przez noc i zakażone natychmiast po sekcji.

1. Poczekaj, aż CM osiągnie RT lub umieść go w łaźni wodnej wstępnie podgrzanej do 37°C. Przed użyciem uzupełnij CM roztworem antybiotyku (CMT). Wyrzuć wszelkie resztki roztworu antybiotyku. Wlej 70% roztwór etanolu do czystego pojemnika, aby namoczyć kleszcze i skalpel w razie potrzeby podczas procedury preparacji. Wyczyść narzędzia i wymieniaj ostrze skalpela między sekcjami próbek od wielu dawców.
2. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś próbkę z pojemnika transportowego na szalkę Petriego o średnicy 100 mm zawierającą 10–20 ml CMT.
3. Użyj pokrywki szalki Petriego jako powierzchni tnącej do wycięcia tkanki. Delikatnie przytrzymując tkankę kleszczami, oddzielić błonę śluzową szyjki macicy i/lub szyjki macicy od znajdującej się pod spodem tkanki zrębu i mięśniowej (podśluzówki) za pomocą skalpela i ostrza, aby uzyskać paski błony śluzowej.
   nuta: Podczas pracy na jednym kawałku tkanki ważne jest, aby reszta tkanki była zanurzona w podłożu, aby uniknąć wysuszenia tkanki.
4. Pokrój błonę śluzową na paski o szerokości 2 mm, a następnie usuń i wyrzuć jak najwięcej błony podśluzowej, pozostawiając tylko warstwę tkanki o grubości 2 mm. Pokrój paski na bloki o grubości 2 mm. Powinno to skutkować eksplantatami tkanek o wielkości około 8 mm³,
   Ostrzeżenie: Posługiwanie się ostrymi narzędziami do preparowania próbek ludzkich zwiększa ryzyko obrażeń i zanieczyszczenia. Operator powinien rozważyć założenie rękawic metalowych, siatkowych i odpornych na przecięcia jako dodatkowej ochrony.
5. Przenieś eksplantaty tkanek na nową 100-milimetrową szalkę Petriego zawierającą 10–20 ml CMT, aby uniknąć wysuszenia tkanek podczas przeprowadzania sekcji. Pod koniec sekcji zakręć płytką, aby losowo określić rozkład eksplantatów.
6. Za pomocą sterylnych kleszczyków przenieś eksplantaty do sterylnej stożkowej probówki (probówek) stożkowej o pojemności 1,5 ml (maksymalnie 16 eksplantatów na probówkę). Usunąć wszelkie medium z probówki za pomocą pipety.
7. Rozmrozić preparat HIV-1 w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. W razie potrzeby rozcieńczyć zapas wirusa za pomocą CM. Przenieść wirusa do probówki (probówek) zawierających eksplantaty. Wyrzuć wszelkie pozostałości preparatu wirusowego.
   nuta: Zapas wirusa należy rozcieńczyć tak, aby wybrane inokulum zawierało się w objętości minimum 0,5 ml (Tabela 1). Aby zmniejszyć zmienność wyników między niezależnymi eksperymentami, ten sam preparat wirusa powinien być stosowany w całym badaniu (tabela materiałów).
8. Przenieść probówki do wytrząsarki termicznej i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37°C, kołysząc się z prędkością 300 obr./min. Delikatnie odwróć probówki kilka razy co 30–60 minut.
   Uwaga: Aby infekcja przebiegła sprawnie, konieczne jest wykorzystanie minimalnego czasu wymaganego między rozmrożeniem preparatu HIV-1 a przeniesieniem probówek do temperatury 37 °C.
9. Napełnij 6-dołkową płytkę 3-4 ml na studzienkę sterylnego buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS). Podczas inkubacji z HIV-1 wyrzucić cały preparat wirusa z probówki (probówek) do pojemnika z roztworem dezynfekującym za pomocą pipety. Przenieść eksplantaty do 6-dołkowej płytki zawierającej PBS za pomocą kleszczy.
10. Pozostaw eksplantaty do odpoczynku w PBS przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, a następnie umyj je, delikatnie pipetując PBS w górę iw dół do studzienki 2-3 razy. Wyrzucić PBS do pojemnika z roztworem dezynfekującym za pomocą pipety. Dodaj 3-4 ml nowego PBS do każdej studzienki. Powtórz jeszcze dwa razy, w sumie trzy prania. Wyrzuć PBS tuż przed przeniesieniem eksplantatów do gąbek, aby uniknąć wysuszenia tkanek.
    nuta: Eksplantaty błony śluzowej szyjki macicy, a w szczególności szyjki macicy, uwalniają duże ilości śluzu podczas infekcji. Bardzo ważne jest, aby umyć i usunąć jak najwięcej śluzu, ponieważ niespecyficzne zatrzymywanie na eksplantatach i późniejsze uwalnianie wirusa do supernatantu hodowli może maskować replikację wirusa.
11. Za pomocą kleszczy przenieś 5-8 eksplantatów na wierzch każdej gąbki żelatynowej na 12-dołkowej płytce. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze.
12. Wszystkie odpady biologiczne należy utylizować w przeciwległych pojemnikach zgodnie z przepisami instytutu dotyczącymi obchodzenia się z niebezpiecznymi materiałami biologicznymi i szczegółową oceną ryzyka.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pianka żelowa 12-7 mm Wchłanialna gąbka żelatynowa	Pfizer	NDC: 0009-0315-08	Gelfoam i Spongostan sprawdzają się równie dobrze w histokuturze zarówno dla tkanki migdałkowej, jak i szyjki macicy.
SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Wchłanialna hemostatyczna gąbka żelatynowa	Wyroby medyczne Ferrosan	Biuletyn MS0002	Gelfoam i Spongostan sprawdzają się równie dobrze w histokuturze zarówno dla tkanki migdałkowej, jak i szyjki macicy.
RPMI 1640 z czerwienią fenolową i glutaminą	ThermoFisher Naukowy	21875034	Aby RPMI1640 dodać aminokwasy endogenne MEM, pirogronian sodu, gentamycynę, amfoterycynę B i FBS 15% (v/v) w celu uzyskania pożywki hodowlanej (CM).
Sterylny roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS) o pH 7,4 bez czerwieni wapniowej, magnezowej i fenolowej			Do przechowywania i transportu próbek chirurgicznych. PBS można zastąpić innym roztworem izotonicznym o fizjologicznym pH. Pożywka hodowlana najlepiej nadaje się do przechowywania przez noc.
Sterylna woda do hodowli komórkowych
70% roztwór etanolu
Roztwór dezynfekujący do usuwania odpadów biologicznych
Sterylne metalowe kleszczyki lub pęsety
Sterylne metalowe nożyczki
Sterylna płaska metalowa szpatułka do ważenia
Sterylne skalpele i ostrza
6-dołkowe płytki do hodowli komórkowych
Sterylna szalka Petriego, 100 mm × 20 mm
Bezkomórkowy preparat wirusa HIV-1 HIV-1BaL	Program odczynników NIH AIDS	510	Wirus powinien być rozmnażany, aby wytworzyć stado wystarczająco duże, aby można było przeprowadzić kilka eksperymentów. Zawiesina wirusa podakwotowego i przechowywać w temperaturze -80 °C. Unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.
Bezkomórkowy preparat wirusa HIV-1 HIV-1LAI.04	Program odczynników NIH AIDS	2522	Wirus powinien być rozmnażany, aby wytworzyć stado wystarczająco duże, aby można było przeprowadzić kilka eksperymentów. Zawiesina wirusa podakwotowego i przechowywać w temperaturze -80 °C. Unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.
Sterylne probówki z nakrętkami 1,5 i 2 ml
Łaźnia wodna o temperaturze 37 °C
Szafa bezpieczeństwa biologicznego
Wytrząsarka do kąpieli suchej z blokiem grzewczym do probówek 1,5 ml, ustawiona na 37 °C, 300 obr./min

powiedział: szt. TGL