$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Pomiar bioaktywnego IFN typu I przy użyciu komórek reporterowych HEK-Blue IFN-α/β.
Uwaga: Te komórki zostały wygenerowane przez stabilną transfekcję komórek HEK293 z ludzkimi genami STAT2 i IRF9 w celu uzyskania w pełni aktywnej ścieżki sygnałowej IFN typu I. Zawierają one również gen reporterowy wydzielanej fosfatazy alkalicznej (SEAP) pod kontrolą indukowanego przez IFN-α/β promotora ISG54. Stymulacja tych komórek IFN typu I aktywuje szlak JAK/STAT/ISGF3 i indukuje produkcję SEAP.
- Utrzymuj komórki HEK-Blue IFN-α/β w DMEM uzupełnione 10% FBS. Płytkować je z gęstością 50 000 komórek na basenie na płaskiej 96-dołkowej płytce, o końcowej objętości 180 μl.
- Zmieszać 220 μl PBMC (rozcieńczonych w 850 000 komórek/ml) lub 220 μl plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych (pDC) (w stężeniu w zakresie od 100 000 do 500 000 komórek/ml) z 30 μl zakażonych limfocytów T (rozcieńczonych w 106 komórek/ml) na dołek w 96-dołkowej płytce z dnem U.
- Inkubować kokultury w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 18-22 godzin, a następnie przenieść je na 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V. Wirować przez 5 minut przy 400 x g.
- Dodać 20 μl supernatantu do każdej studzienki w dwóch egzemplarzach. Każda płytka wymaga również zestawu wewnętrznych wzorców kontrolnych (ludzki IFNα, stężenie końcowe od 100 U/ml do 2 500 U/ml). Inkubować płytki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 18-22 godzin.
- Oznaczyć poziomy aktywności fosfatazy alkalicznej za pomocą roztworu QUANTI-Blue, który zmienia kolor z różowego na fioletowy/niebieski w obecności enzymu. Przygotuj QUANTI-Blue zgodnie z zaleceniami producenta. Dodać 180 μl tego roztworu do każdego dołka na płaskodennej 96-dołkowej płytce. Do każdej studzienki dodać również 20 μl indukowanych supernatantów komórek HEK-Blue IFN-α/β i inkubować płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, aż w standardowych studzienkach kontrolnych IFN pojawi się kolor.
- Ocenić poziomy SEAP za pomocą spektrofotometru przy 620-655 nm i określić stężenie IFN typu I przez ekstrapolację z liniowej części krzywej wzorcowej IFN.