Oznaczanie ilościowe bioaktywnych interferonów typu I przy użyciu testu reporterowego wydzielanej embrionalnej fosfatazy alkalicznej

Abstract

Źródło: Bego, M. G. et al., Ocena wrodzonego wykrywania limfocytów T CD4⁺ zakażonych wirusem HIV-1 przez plazmocytoidalne komórki dendrytyczne przy użyciu systemu kohodowli ex vivo. J. Vis. Exp. (2015)

Ten film demonstruje test wydzielania embrionalnej fosfatazy alkalicznej przy użyciu komórek reporterowych interferonu HEK-Blue α/β do ilościowego określenia interferonów typu I (IFN) uwolnionych po stymulacji plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych przez limfocyty T CD4⁺ zakażone HIV-1.

Protocol

1. Pomiar bioaktywnego IFN typu I przy użyciu komórek reporterowych HEK-Blue IFN-α/β.

Uwaga: Te komórki zostały wygenerowane przez stabilną transfekcję komórek HEK293 z ludzkimi genami STAT2 i IRF9 w celu uzyskania w pełni aktywnej ścieżki sygnałowej IFN typu I. Zawierają one również gen reporterowy wydzielanej fosfatazy alkalicznej (SEAP) pod kontrolą indukowanego przez IFN-α/β promotora ISG54. Stymulacja tych komórek IFN typu I aktywuje szlak JAK/STAT/ISGF3 i indukuje produkcję SEAP.

1. Utrzymuj komórki HEK-Blue IFN-α/β w DMEM uzupełnione 10% FBS. Płytkować je z gęstością 50 000 komórek na baseni....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ogniwa MT4	Program odczynników NIH AIDS	120	Ten odczynnik został uzyskany za pośrednictwem NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: MT-4 od dr Douglasa Richmana.
Komórki reporterowe HEK-Blu IFN-α/β	Szczepionka Invivogen	HKB-IFNAB
Prędkość obrotowa	żubr	350-000-CL
DMEM (DMEM)	żubr	319-005-CL
FBS (Sieć Usługowa	żubr	080-150
PHA-L	Sigma-Aldrich	Numer O2769
Zestaw do izolacji limfocytów T CD4+ II	Myltenyi	130-091-155
Diamentowy zestaw do izolacji komórek dendrytycznych plazmocytoidowych II	Myltenyi	130-097-240
QUANTI-Niebieski	Cedrowy	REP-QB2 (Przedstawiciel QB2
2,5 mg/ml ludzkiej IgG	Sigma-Aldrich	I 4506