Technika wytwarzania cząstek podobnych do wirusa grypy przez system ssaków

Streszczenie

Źródło: Arevalo, M. T., et al.Ekspresja i oczyszczanie cząsteczek wirusopodobnych do szczepienia. J. Vis. Exp. (2016).

Ten film pokazuje generowanie cząsteczek wirusopodobnych do grypy (VLP) w organizmie ssaków. Po ekspresji trzech eukariotycznych wektorów ekspresyjnych - kodujących różne białka strukturalne wirusa - w odpowiednich komórkach gospodarza ssaków, wyrażone białka wirusowe samoorganizują się w VLP na błonie plazmatycznej gospodarza i uwalniają się poprzez pączkowanie z powierzchni komórki.

Protokół

1. System ekspresji ssaków do generowania wirusa grypy H3N2 VLP

1. Subklonowane wirusowe glikoproteiny strukturalne hemaglutynina (HA), neuraminidaza (NA) i ludzki wirus niedoboru odporności (HIV) Gag (antygen specyficzny dla grupy) p55 do eukariotycznych wektorów ekspresyjnych, takich jak wcześniej opisany pTR600.
2. Amplifikować DNA w chemicznie kompetentnych Escherichia coli (np. DH5α) i wyizolować plazmid klasy transfekcyjnej za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu zgodnie z instrukcjami producenta. Ilość DNA zależy od plonu i potrzeb użytkownika.
3. Utrzymać linię komórkową ssaków, 293T, w pożywce wzrostowej zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ w wilgotnym inkubatorze.
4. Hodować komórki w taki sposób, aby kolba do hodowli tkankowej T-150 zawierała 45-75 x 10⁶ komórek na kolbę, tak aby kolba uzyskała całkowite przyleganie komórek i 85-95% zbiegu komórek do następnego dnia. Sprawdź komórki pod mikroskopem pod kątem pożądanej konfluencji.
   nuta: Zazwyczaj zaleca się wysoką gęstość komórek w celu uzyskania optymalnej ekspresji białka przy minimalnej cytotoksyczności przy użyciu komercyjnych odczynników do transfekcji, jednak nadmierna konfluencja może powodować gromadzenie się produktów ubocznych odpadów komórkowych i zmniejszać żywotność komórek.
5. W dniu transfekcji należy przygotować mieszaninę liposomu i DNA zgodnie z zaleceniami producenta i dokonać transfekcji komórek DNA o składzie DNA 1:1:2 HA:NA:Gag o łącznej ilości DNA 40 μg na kolbę T-150. Rozcieńczyć DNA i roztwory liposomów w pożywkach do transfekcji bez surowicy bez antybiotyków, tak aby każda kolba zawierała całkowitą objętość 20-30 ml.
   nuta: Stosunek konstruktów genów może wymagać optymalizacji przez użytkownika. Chociaż nie wykazano tego tutaj, podobną procedurę transfekcji przeprowadzono z użyciem syncytialnego wirusa oddechowego (RSV) F i HIV Gag w stosunku 1:1. W przypadku plazmidów jednoekspresyjnych DENV i CHIKV w celu uzyskania optymalnej ekspresji stosuje się łącznie 20 μg DNA na kolbę T-150. Proporcje odczynników DNA:transfekcja są zoptymalizowane pod kątem użytkownika. Stosować zalecaną pożywkę do transfekcji w oparciu o metodę transfekcji, tj. polikationowe transfekcje lipidowe zalecają zmniejszenie lub brak płodowej surowicy bydlęcej, dlatego pożywki mogą być uzupełnione hormonami wzrostu i pierwiastkami śladowymi w celu wsparcia wzrostu przy braku surowicy.
6. Kolby należy przywrócić do temperatury 37 °C za pomocą inkubatora o stężeniu 5% CO_{2 .} Na objętość 200 ml należy użyć 9 kolb T-150. Komórki są utrzymywane w pożywce do hodowli transfekcyjnej do dnia zbioru VLP.
7. Zebrać supernatant kultury z komórek po 72-96 godzinach po transfekcji w zależności od antygenu lub gdy żywotność komórek spadła do 70-80%, zgodnie z oszacowaniem kontroli mikroskopowej. Przenieść supernatant do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i odwirować komórki w temperaturze 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia szczątków komórkowych.
   Uwaga: Zastąpienie 3-dniowego supernatantu świeżym, wstępnie ogrzanym, wolnym od surowicy podłożem do transfekcji na przylegające komórki spowoduje uzyskanie drugiej partii VLP o podobnej lub nieznacznie zmniejszonej wydajności i powinno zostać zoptymalizowane przez użytkownika.
8. Zebrać supernatant w puli i przefiltrować przez membranę porową 0,22 μm przed sedymentacją za pomocą ultrawirowania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw Maxi Plazmid	Qiagen powiedział:	Numer katalogowy: 12163
DMEM (DMEM)	Komórka	10-013
Lipofektamina	Technologie życiowe	L3000075	Lipofektamina 2000, Lipofektamina 3000
Opti-MEM I	Technologie życiowe	31985062
Mieszadło wielopunktowe Cimarec I 6	ThermoFisher Naukowy	50094596
Probówki ultrawirówkowe Polyclear	Seton	Zobacz materiał 7025
Górna część filtra próżniowego 0,22 μm (500 ml)	Nalgene powiedział:	569-0020
glicerol	Sigma	Zobacz materiał G5516

TGL