Wytwarzanie cząstek podobnych do wirusa Chikungunya przy użyciu systemu ekspresji bakulowirusa w komórkach owadów

Streszczenie

Źródło: Arevalo, M. T. et al., Ekspresja i oczyszczanie cząsteczek wirusopodobnych do szczepień.J. Vis. Exp. (2016)

Ten film pokazuje, jak cząsteczki wirusopodobne, VLP, są generowane przez infekowanie komórek owadów rekombinowanym bakulowirusem przenoszącym kasetę z genami wirusa chikungunya. Rekombinowany wirus infekuje komórki, prowadząc do powstawania, składania i uwalniania VLP do pożywki hodowlanej w celu potencjalnego wykorzystania w produkcji szczepionek.

Protokół

1. Ekspresja cząsteczek wirusopodobnych Chikungunya (VLP) przy użyciu systemu komórkowego bakulowirusa/owadów

1. Wygeneruj rekombinowanego bakulowirusa wykazującego ekspresję kapsydu wirusa chikungunya i białek otoczki (C-E3-E2-6K-E1) ze szczepu S-27 przy użyciu komercyjnego systemu ekspresji bakulowirusa.
2. Hodowla komórek Spodoptera frugiperda Sf9 w pożywce wzrostowej Sf9 bez surowicy ze 100 j./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny w temperaturze 28 °C. Użyć 3-5 x 10⁵ c/ml w celu zainicjowania hodowli w kolbach przędzalniczych w celu wzrostu komórek zawiesinowych. Pasaż rutynowo, gdy osiągną gęstość komórek 2-4 x 10⁶ c/ml (co 3-4 dni).
3. Hodowla komórek Sf9 w zawiesinie w kolbach wirujących z mieszaniem przy 130 obr./min na wielopunktowym systemie płytek mieszających. W celu prawidłowego napowietrzenia należy utrzymywać objętość kultur na poziomie nie większym niż połowa objętości kolby obrotowej.
4. W celu ekspresji Chikungunya lub CHIK VLP należy zainfekować komórki Sf9 o gęstości 2 x 10⁶ komórek/ml rekombinowanym bakulowirusem przy wielokrotności infekcji 1 i powrócić do inkubatora w temperaturze 28 °C. Zazwyczaj należy zainfekować jedną lub dwie kolby przędzarki, zawierające 250 ml komórek Sf9.
   nuta: Chociaż nie stosujemy tej metody, komórki Sf9 mogą być hodowane w kolbach wytrząsających w temperaturze 28 °C przy użyciu platformy wytrząsającej.
5. Kultury należy zbierać po 72-96 godzinach od zakażenia lub gdy żywotność komórek spadła do 70-80%, zgodnie z wykluczeniem błękitu trypanowego zgodnie z protokołem producenta.
   nuta: Komórki nadal namnażają się podczas infekcji i istnieje ~ 80% żywotności w kulturach Sf9 zakażonych rekombinowanym bakulowirusem CHIK VLP po 3 dniach od infekcji (dpi). Komórki zakażone bakulowirusem mają większy wygląd. Morfologia może również zmieniać się z okrągłej na podłużną. W późnych stadiach infekcji bakulowirusem komórki zaczęły się lizować.
6. Przenieść kultury bezpośrednio z hodowli zawiesinowej do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i wirować komórki w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
7. Zebrać supernatanty i przefiltrować przez membranę porową 0,22 μm przed sedymentacją za pomocą ultrawirowania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Opti-MEM I	Technologie życiowe	31985062
System ekspresji bakulowirusa Bac-to-Bac	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 10359-016
Górna część filtra próżniowego 0,22 μm (500 ml)	Nalgene powiedział:	569-0020
SFM SF-900 II	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy: 10902-096
Mieszadło wielopunktowe Cimarec I 6	ThermoFisher Naukowy	50094596