Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Postępowanie ze zwierzętami, przygotowanie i wywoływanie stanu zapalnego
- Użyj 4-6 tygodniowych samców myszy o wadze 16 - 20 g. Uwaga: Jeśli myszy są starsze lub cięższe, wykazują nadmierną ilość tłuszczu otaczającego naczynie, co ogranicza obserwację mikroskopową.
- Wysterylizuj wszystkie narzędzia i stół mikroskopowy przed zabiegiem.
- Wstrzyknąć 20 mg/kg LPS (lipopolisacharyd) dootrzewnowo na 4 godziny przed mikroskopią żywej myszy w celu wywołania zapalenia bakteryjnego.
- Podgrzej 0,9% roztwór soli fizjologicznej w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C, aby nawilżyć plastikową komorę i tkankę krezkową.
- Znieczulić mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (5 mg/kg) tuż przed zabiegiem mikroskopowym. Można zastosować alternatywne znieczulenie, np. inhalację 2% izofluranu. Potwierdź prawidłowe znieczulenie przez utratę odpowiedzi na stymulację odruchową (szczypanie palca u nogi lub ogona przy mocnym nacisku).
- Zdepiluj brzuch za pomocą golarki i usuń luźne włosy gazą nasączoną etanolem 70%.
- Nałóż maść weterynaryjną na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
2. Chirurgia
- Wysterylizuj brzuch przy użyciu 70% etanolu. Ta metoda nie jest metodą sterylną i może być śmiertelna pod koniec eksperymentu.
- Wykonaj laparotomię pośrodkową: Otwórz skórę brzucha za pomocą małych, zakrzywionych kleszczy i małych nożyczek. Zidentyfikuj naczynia w nadbrzuszu i otwórz otrzewną w okolicy kresy białej, aby chronić naczynia.
- Nałóż kilka kropli podgrzanej soli fizjologicznej do jamy brzusznej, aby utrzymać wilgotność tkanki.
- Znakować fluorescencyjnie leukocyty i płytki krwi, wstrzykując 50 μl rodaminy 6G (1 mg / ml) po ornocie.
- Zewnętrznie zewnętrzizować pętlę jelita krętego i umieścić ją na szalce Petriego o średnicy 10 cm; upewnij się, że tkanka jest wilgotna, stosując wstępnie podgrzany roztwór soli o temperaturze 37 °C (0,9%) co drugą minutę.
3. Mikroskopia przyżyciowa
- Umieść mysz pod mikroskopem i umieść żyłę krezkową o średnicy 200 - 300 μm w centrum view. Wybierz naczynie bez widocznego tłustego otoczenia.
- Nie dotykaj naczyń krezki, unikając w ten sposób stymulacji śródbłonka. Z pętlą jelita krętego należy obchodzić się ostrożnie.
- Wizualizuj interakcje między komórkami krwi a śródbłonkiem za pomocą mikroskopu odwróconego lub pionowego i kamery za pomocą oprogramowania mikroskopowego. Rejestruj interakcje między komórkami krwi a śródbłonkiem przez 1 minutę w 4 różnych żyłach na mysz.
- Poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy po zakończeniu eksperymentów obrazowych.
4. Analiza
- Przeprowadź analizę w trybie offline i na ślepo dla wszystkich parametrów. Przeprowadź analizę za pomocą dowolnego odpowiedniego oprogramowania.
- Potwierdź stabilne i międzyosobniczo porównywalne warunki przepływu krwi w klipach filmowych o wysokiej rozdzielczości czasowej (maksymalna liczba klatek na sekundę) skoncentrowanych na wewnątrzświetlnym przepływie krwinek.
- Określ ilościowo liczbę toczących się leukocytów. Dlatego narysuj pionową linię przechodzącą przez żyłę i policz wszystkie leukocyty przecinające tę linię w ciągu 1 minuty.
- Określ prędkość toczenia, mierząc czas, w którym pojedynczy leukocyt musi przejść odległość 50 μm, stabilnie tocząc się po śródbłonku. Aby to zrobić, narysuj dwie pionowe linie w odległości 50 μm przez żyłę.
- Zmierz czas, w którym reprezentatywny leukocyt musi przejść z jednej linii do drugiej. Oblicz prędkość leukocytów, dzieląc 50 μm przez potrzebny czas (μm/s).
- Zmierz adhezję leukocytów w polu 0,04 mm2. Aby to zrobić, narysuj kwadrat o boku długości 200 μm do żyły.
- Policz twarde przylegające leukocyty, zdefiniowane jako brak widocznego ruchu przez 30 sekund, w tym kwadracie.
- Policz liczbę płytek krwi związanych z jednym leukocytem, aby określić ilościowo interakcje płytk-leukocyty.
