Przygotowanie i oznaczanie ilościowe inokulum Mycobacterium bovis BCG lux do zakażenia

Streszczenie

Źródło: Asai, M. et al., Wykorzystanie Invertebrate Galleria mellonella jako modelu infekcji do badania kompleksu Mycobacterium tuberculosis. J. Vis. Exp. (2019)

Ten film demonstruje przygotowanie i kwantyfikację inokulum Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin lux za pomocą testu bioluminescencyjnego i liczenia jednostek tworzących kolonie. Przygotowane inokulum można wykorzystać do badań nad infekcjami.

Protokół

UWAGA: Wszystkie prace opisane poniżej mają być wykonywane w laboratorium CL2 w komorze bezpieczeństwa mikrobiologicznego klasy 2 (MSC) zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi zdrowia i bezpieczeństwa.

1. Przygotowanie M. bovis BCG lux do infekcji

1. Rozmrozić zamrożony 1,2 ml glicerolu (15%) zapasu M. bovis BCG lux, szczepu szczepionki montrealskiej przekształconego za pomocą plazmidu wahadłowego pSMT1 przenoszącego geny luxAB z Vibrio harveyi kodujące enzym lucyferazy.
2. Zaszczepić 15 ml bulionu Middlebrook 7H9 zawierającego 0,2% glicerolu, 10% albuminy, dekstrozę, wzbogacenie katalazą (ADC) i 50 μg/ml higromycyny rozmrożoną 1,2 ml porcji BCG lux, w oznakowanej kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml.
3. Umieścić kolbę w szczelnie zamkniętym pojemniku zapewniającym bezpieczeństwo biologiczne i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną z prędkością 220 obr./min przez 72 godziny (lub do momentu, gdy kultura osiągnie środkową fazę wzrostu).
4. Sprawdź wzrost kultury BCG lux, przygotowując rozcieńczenia kultury w stosunku 1:10 w probówkach luminometru przy użyciu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,4, 0,01 M bufor fosforanowy, 0,0027 M chlorek potasu i 0,137 M chlorek sodu) w dwóch egzemplarzach. Wirować i załadować rurki luminometru do luminometru i zmierzyć bioluminescencję (względną jednostkę światła [RLU]/ml) przy użyciu aldehydu n-decylowego jako podłoża (1% v/v w absolutnym etanolu).
   nuta: Stosunek RLU do jednostek tworzących kolonię (CFU) został wcześniej określony na 3:1, gdy BCG lux był hodowany in vitro w bulionie Middlebrook 7H9.
5. Odwirować kulturę przy 2,175 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia komórek i odrzucenia supernatantu do odpowiedniego środka dezynfekującego o znanej aktywności prątkobójczej. Wszystkie odpady z kultur należy zutylizować środkami dezynfekującymi odpowiednimi dla prątków zgodnie z lokalnymi wytycznymi.
6. Umyj osad komórkowy dwukrotnie w PBS zawierającym 0,05% polisorbatu 80 (PBS-T), aby zapobiec zbrylaniu się bakterii.
7. Po ostatnim płukaniu zdekantować supernatant odpadowy, ponownie zawiesić osad komórek mykobakteryjnych w PBS-T i rozcieńczyć zawiesinę prątków do pożądanej gęstości komórek za pomocą pomiarów RLU.
8. Przygotować dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia inokulum w 24-dołkowych płytkach przy użyciu PBS-T. Umieść 10 μl na płytkach agarowych Middlebrook 7H11 (0,5% glicerolu, 50 μg/ml higromycyny, 10% kwasu oleinowego, albuminy, dekstrozy, katalazy [OADC]) w dwóch egzemplarzach, aby wyliczyć liczbę CFU inokulum.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1,5 ml probówka reakcyjna (Eppendorf)	Eppendorf	22431021
Pipety o pojemności 20, 200 i 1000 μl oraz końcówki z filtrem	Każdy dostawca	N/a
24-dołkowa płytka hodowlana	Greiner	Numer katalogowy: 662160
Pipety 25 ml i chłopiec do pipet	Każdy dostawca	N/a
3-komorowa szalka Petriego (94/15mm)	Greiner	637102
wirówka	Każdy dostawca	N/a
Szafa bezpieczeństwa klasy II	Każdy dostawca	N/a
Etanol (>99,7%)	Firma VWR	208221.321
glicerol	Sigma-Aldrich	Klasa g5150
Higromycyna B	Corning	30-240CR
Luminometr (Autolumat LB 953)	Berthold	Numer katalogowy: 34622
Lampy luminometru	Corning	352054
Mikrowirówka	Każdy dostawca	N/a
Agar Middlebrook 7H11	BD Bioscience	Numer katalogowy: 283810
Rosół Middlebrook 7H9	BD Bioscience	Numer katalogowy: 271310
Wzbogacenie ADC Middlebrook	BD Bioscience	212352
Wzbogacenie Middlebrook OADC	BD Bioscience	Numer katalogowy: 212240
Mycobacterium bovis BCG lux	rozmaity	N/a
Aldehyd n-decylowy	Sigma-Aldrich	D7384-100G
Inkubator z wytrząsaniem orbitalnym	Każdy dostawca	N/a
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
Polisorbat 80 (Tween-80)	Sigma-Aldrich	P8074-500ml
Kolba Erlenmeyera z wentylowanym korkiem (250 ml)	Corning	CLS40183
Winterm (wersja 1.08)	Berthold	N/a	Program LB953.TTB