UWAGA: Wszystkie prace opisane poniżej mają być wykonywane w laboratorium CL2 w komorze bezpieczeństwa mikrobiologicznego klasy 2 (MSC) zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi zdrowia i bezpieczeństwa.
1. Przygotowanie M. bovis BCG lux do infekcji
- Rozmrozić zamrożony 1,2 ml glicerolu (15%) zapasu Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG) lux, szczepu szczepionki montrealskiej przekształconego za pomocą plazmidu wahadłowego pSMT1 przenoszącego geny luxAB z Vibrio harveyi kodujące enzym lucyferazy.
- Zaszczepić 15 ml bulionu Middlebrook 7H9 zawierającego 0,2% glicerolu, 10% albuminy, dekstrozę, wzbogacenie katalazą (ADC) i 50 μg/ml higromycyny rozmrożoną 1,2 ml porcji BCG lux, w oznakowanej kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml.
- Umieścić kolbę w szczelnie zamkniętym pojemniku zapewniającym bezpieczeństwo biologiczne i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną z prędkością 220 obr./min przez 72 godziny (lub do momentu, gdy kultura osiągnie środkową fazę wzrostu).
- Sprawdź wzrost kultury BCG lux, przygotowując rozcieńczenia kultury w stosunku 1:10 w probówkach luminometru przy użyciu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,4, 0,01 M bufor fosforanowy, 0,0027 M chlorek potasu i 0,137 M chlorek sodu) w dwóch egzemplarzach. Odwiruj i załaduj rurki luminometru do luminometru i zmierz bioluminescencję (względną jednostkę światła [RLU]/ml) używając aldehydu n-decylowego jako podłoża (1% v/v w absolutnym etanolu).
UWAGA: Stosunek RLU do jednostek tworzących kolonie (CFU) został wcześniej określony na 3:1, gdy BCG lux był uprawiany in vitro w bulionie Middlebrook 7H9.
- Odwirować kulturę przy 2,175 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia komórek i odrzucenia supernatantu do odpowiedniego środka dezynfekującego o znanej aktywności prątkobójczej. Wszystkie odpady z kultur należy zutylizować środkami dezynfekującymi odpowiednimi dla prątków zgodnie z lokalnymi wytycznymi.
- Umyj osad komórkowy dwukrotnie w PBS zawierającym 0,05% polisorbatu 80 (PBS-T), aby zapobiec zbrylaniu się bakterii.
- Po ostatnim płukaniu zdekantować supernatant odpadowy, ponownie zawiesić osad komórek mykobakteryjnych w PBS-T i rozcieńczyć zawiesinę prątków do pożądanej gęstości komórek za pomocą pomiarów RLU.
- Przygotować dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia inokulum w 24-dołkowych płytkach przy użyciu PBS-T. Umieść 10 μl na płytkach agarowych Middlebrook 7H11 (0,5% glicerolu, 50 μg/ml higromycyny, 10% kwasu oleinowego, albuminy, dekstrozy, katalazy [OADC]) w dwóch egzemplarzach, aby wyliczyć liczbę CFU inokulum.
2. Przygotowanie larw G. mellonella
- Kupuj larwy w ostatnim stadium rozwoju z odpowiednich źródeł i utrzymuj larwy w ciemności w temperaturze 18 °C po przybyciu i zużyciu w ciągu 1 tygodnia od zakupu. Alternatywnie, larwy mogą być hodowane samodzielnie zgodnie z protokołem Jojāo i wsp. W przypadku zakupionych larw należy wyrzucić wszelkie martwe, odbarwione lub przepoczwarzające się larwy przed przechowywaniem.
UWAGA: Larwy przepoczwarzające się są morfologicznie odróżnialne od larw ostatniego stadium rozwojowego.
- Zidentyfikuj i wybierz zdrowe larwy do eksperymentów, na podstawie jednolitego kremowego koloru z niewielkimi lub żadnymi przebarwieniami (melanizacja), rozmiarem (2-3 cm długości), wagą (około 250 mg), wykazującymi wysoki poziom ruchliwości i posiadającymi zdolność do prostowania się po odwróceniu.
- Ostrożnie policz zdrowe larwy (minimum 20−30 na grupę) na szalkę Petriego (94/15 mm) wyłożoną warstwą bibuły filtracyjnej (94/15 mm) za pomocą pęsety z końcem, aby zminimalizować zanieczyszczenie i przechowywać w temperaturze pokojowej w ciemności do czasu użycia.
3. Zakażenie G. mellonella BCG lux
- Zminimalizuj bałagan w MSC, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia i zranienia igłą.
- Przygotować platformę iniekcyjną, przyklejając okrągłą bibułę filtracyjną (94 mm) do płaskiej, podniesionej powierzchni. Można używać miękkich lub twardych powierzchni, które są całkowicie zależne od preferencji użytkownika, np. pokrywki pudełek na pipety lub nylonowa gąbka do szorowania.
- Wysterylizuj mikrostrzykawkę o pojemności 25 μl (25 G), odsysając 3 objętości 70% etanolu, a następnie przepłukać 3 objętościami sterylnego PBS-T.
- Odessać 10 μl inokulum BCG lux (przygotowanego w sekcji 1) lub PBS-T do wysterylizowanej mikrostrzykawki o pojemności 25 μl. Użyć oddzielnej strzykawki do kontroli negatywnej PBS-T.
UWAGA: Ponownie zawiesić inokulum BCG lux po 10 wstrzyknięciach, aby zapewnić równomierne zawieszenie komórek.
- Za pomocą pęsety wybierz jedną larwę i umieść ją na platformie iniekcyjnej.
- Na platformie przewróć larwę na plecy i unieruchom, zabezpieczając głowę i ogon pęsetą. Zlokalizuj ostatni lewy proleg odliczając w dół od głowy larwy i ostrożnie włóż końcówkę igły (5−6 mm) pod kątem 10−20° do płaszczyzny poziomej.
nuta: Krótka i wąska pęseta pozwala na łatwe unieruchomienie przy minimalnym stresie larwalnym. Zwróć uwagę, aby nie przeniknąć nadmiernie, co może przebić jelito i spowodować melanizację lub śmierć niespecyficzną dla BCG luksów.
- Policz zainfekowane larwy na szalce Petriego wyłożonej warstwą bibuły filtracyjnej, pojedyncza szalka Petriego o średnicy 90 mm może pomieścić do 30 larw.
- Przechowywać szalkę Petriego zawierającą larwy w wentylowanym lub nieszczelnie zamkniętym ciemnym pudełku w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 .
4. Monitorowanie przeżywalności G. mellonella po zakażeniu
- W miarę upływu czasu monitoruj przeżywalność larw co 24 godziny. Larwy są uważane za martwe, gdy nie poruszają się w odpowiedzi na dotyk.
5. Pomiar in vivo obciążenia luksami BCG u G. mellonella
- W każdym punkcie czasowym losowo wybieraj pięć zakażonych larw przygotowanych wcześniej w sekcji 3 i delikatnie sterylizuj powierzchnie larw za pomocą wacików nasączonych 70% etanolem.
UWAGA: Ten krok jest ważny podczas posiewu homogenatu larwalnego w celu zliczenia prątków CFU, ponieważ niesterylizowane larwy mogą prowadzić do zanieczyszczenia.
- Umieścić larwy pojedynczo w probówkach z matrycą lizy o pojemności 2 ml zawierających 800 μl sterylnego PBS.
- Homogenizować larwy za pomocą homogenizatora przez 60 s z prędkością 6,0 m/s.
- Odwirować probówki lizujące o sile 3 500 x g przez 5 sekund w celu usunięcia homogenatu z pokrywek i ostrożnie zdekantować homogenat indywidualnie do sterylnych probówek luminometru.
nuta: W przypadku oznaczania liczby CFU (krok 5.7) należy upewnić się, że zarezerwowano 100 μl homogenatu w sterylnej probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml.
- Odzyskać pozostały homogenat przez przemycie probówek z matrycą lizującą 1 ml PBS-T i odpipetować do odpowiednich probówek z luminometrem.
- Wirować rurki luminometru i zmierzyć bioluminescencję homogenatów opisanych wcześniej w kroku 1.4.
- Przygotować dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia homogenatu na 24-dołkowych płytkach hodowlanych przy użyciu PBS-T. Umieścić 10 μl rozcieńczenia na płytkach agarowych Middlebrook 7H11 zawierających 0,5% glicerolu, 50 μg/ml higromycyny, 10% OADC i 20 μg/ml piperacyliny, w celu określenia stosunku RLU/CFU luksów BCG po zakażeniu in vivo.
UWAGA: Piperacylina eliminuje natywną mikrobiotę G. mellonella przy minimalnym hamowaniu wzrostu BCG lux.
