Model myszy w woreczku powietrznym do zbierania wysięku zapalnego wywołanego lipopolisacharydem

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Lu, Q., et al. Wykrywanie migracji i infiltracji neutrofili u myszy. J. Vis. Exp.(2020).

Ten film opisuje procedurę generowania torebki powietrznej w tkance podskórnej myszy i zbierania wysięków zapalnych w odpowiedzi na podanie lipopolisacharydu in vivo. Ten film obejmuje również analizę infiltracji neutrofili w woreczku powietrznym.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Test z użyciem torebki powietrznej

Pierwszy wtrysk powietrza
1. W dniu 0 należy w pełni znieczulić myszy 5% izofluranem przez 3 minuty w komorze do znieczulenia gazowego z prędkością 2 l/min i utrzymywać znieczulenie każdej myszy w pojedynczej jednostce oddechowej z 2% izofluranem z prędkością 0,5 l/min.
  nuta: Wystarczającą głębokość znieczulenia zapewnia się poprzez uszczypnięcie palców u nóg przed przeniesieniem myszy z komory do pojedynczej jednostki oddechowej. Nogi nie powinny się poruszać, gdy palce u nóg są ściśnięte.
2. Użyj filtra 0,22 μm dołączonego do strzykawki o pojemności 5 ml, aby uzyskać 3 ml objętości wysterylizowanego powietrza.
3. Podnieś tylną skórę znieczulonej myszy za pomocą pęsety i wstrzyknij podskórnie 3 ml wysterylizowanego powietrza za pomocą igły 26 G x 3/8".
4. Po leczeniu wyjmij myszy z aparatu oddechowego. Monitoruj myszy, aby upewnić się, że żyją, dopóki nie zaczną się poruszać.
Drugi wtrysk powietrza
1. W dniu 3 wstrzyknąć dodatkowe 3 ml wysterylizowanego powietrza do wcześniej utworzonej kieszeni powietrznej, aby podtrzymać woreczek powietrzny, jak opisano w punkcie 1.1.
leczenie
1. W 6, 6 godzin przed uśmierceniem należy wstrzyknąć różne leki do worka powietrznego. Wstrzyknąć 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) jako kontrolę ujemną. Wstrzyknąć 1 ml 1 μg/ml LPS jako kontrolę pozytywną w celu wywołania miejscowego stanu zapalnego.
2. W pełni znieczulić myszy 5% izofluranem przez 3 minuty w komorze do znieczulenia gazowego z prędkością 2 l/min i utrzymywać znieczulenie każdej myszy w jednej jednostce oddechowej z 2% izofluranem z prędkością 0,5 l/min. Przygotować bufor do płukania zgodnie z tabelą materiałów.
  nuta: Wystarczającą głębokość znieczulenia zapewnia się poprzez uszczypnięcie palców u nóg przed przeniesieniem myszy z komory do pojedynczej jednostki oddechowej. Nogi nie powinny się poruszać, gdy palce u nóg są ściśnięte.
3. Dla każdej saszetki powietrznej należy ją przemyć 1 ml buforu płuczącego i zebrać wysięk zapalny w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Przemyć woreczek z powietrzem 2 ml buforu do przemywania 2x i zebrać wysięk zapalny do tej samej probówki wirówkowej.
4. Wirować przy 100 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu do przemywania się. Policz komórki, aby określić ilościowo stosunek neutrofili za pomocą automatycznego analizatora hematologicznego.
  nuta: Reprezentatywne wyniki przedstawiono na rysunku 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

figure-results-1
Rysunek 1: Reprezentatywne wyniki testu w woreczku powietrznym. (A) Ilustracja testu z użyciem torebki powietrznej. (B) Reprezentatywne wyniki infiltracji podzbioru leukocytów w teście worka powietrznego. PBS: kontrola; LPS: 1 µg/mL LPS. Dane są prezentowane jako średnia ± SD.