Kwantyfikacja obciążenia Helicobacter pylori w zakażonym żołądku myszy

Streszczenie

Źródło: D'Costa, K. et al., Mysie modele zakażenia Helicobacter i patologii żołądka. J. Vis. Exp. (2018)

W tym filmie opisujemy protokół ilościowego oznaczania obciążenia Helicobacter pylori w tkankach żołądka myszy po zakażeniu, aby potwierdzić jego kolonizację.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Potwierdzenie kolonizacji bakteryjnej w żołądku po infekcji

1. Żywotne liczenie H. pylori w żołądku
   1. Uzupełnij sterylne płytki HBA dodatkowymi antybiotykami (200 μg/ml bacytracyny i 10 μg/ml kwasu nalidyksowego) przed wykonaniem liczenia kolonii z zakażonych żołądków myszy.
   2. Homogenizować skrawki żołądka ręcznie, za pomocą autoklawowalnych mikrotłuczków polipropylenowych lub za pomocą mechanicznego przyrządu do dysocjacji (patrz Tabela materiałów).
   3. Przygotować podwójne seryjne rozcieńczenia (10⁻¹ do 10⁻²) powstałych homogenatów żołądkowych w sterylnym BHI.
      nuta: Decyzję o rozcieńczeniu należy podjąć na podstawie typowych ładunków bakteryjnych uzyskanych dla danego szczepu H. pylori stosowanego do zakażenia, a także czasu trwania infekcji. Można również stosować próbki nierozcieńczone.
   4. Wstępnie wysuszone płytki HBA (UWAGA: W celu zapewnienia izolacji pojedynczych kolonii, płytki HBA należy przed użyciem podgrzać i wysuszyć w komorze bezpieczeństwa biologicznego lub inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 10–15 minut) na trzy lub cztery segmenty. Stosując adaptację techniki Milesa i Misry, dodaj 10–100 ml każdego rozcieńczenia na segment płytki agarowej i rozprowadź za pomocą sterylnych plastikowych pętli.
   5. Pozostaw talerze do wyschnięcia, a następnie umieść je w pozycji odwróconej (pokrywką do dołu) w słoikach z gazem beztlenowym. Aby utrzymać wilgotność w słoikach, dołącz szalkę Petriego zawierającą wodę.
   6. Inkubować słoiki w temperaturze 37 °C, aż utworzą się kolonie (zwykle 4–7 dni).
   7. Wylicz segment(y) zawierający od 10 do 100 izolowanych kolonii.
      UWAGA: Kolonie H. pylori i wzrost H. felis na płytkach można odróżnić od innych członków mysiej mikrobioty żołądka za pomocą standardowych testów ureazy, katalazy i oksydazy. H. pylori i H. felis są dodatnie we wszystkich trzech testach.
   8. Obliczyć miano bakteryjne jako (jtk/g tkanki), stosując następujący wzór:
      [(Średnia liczba zliczonych kolonii) × (współczynnik rozcieńczenia) x (objętość platerowana)]/(masa żołądka).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki bakteriologiczne
Oxoid Blood Agar Base No.2	Thermo Fischer Naukowy	CM0271B	Rozpuścić w wodzie deinonizowanej przed sterylizacją
Premium Defibrynowana krew końska	Australijskie Etyczne Środki Biologiczne	PDHB100
Bulion z naparu z serca Bacto Brain	BD Bioscience	Numer katalogowy: 237500	Rozpuścić w wodzie deinonizowanej przed sterylizacją
Pakiety gazowe CampyGen	Thermo Fischer Naukowy	CN0035A/CN0025A
antybiotyki
Wankomycyna	Sigma Aldrich	V2002-1G	Rozpuścić w wodzie dejonizowanej
Polimyksyna B	Sigma Aldrich	P4932-5MU	Rozpuścić w wodzie dejonizowanej
trimetoprim (≥98% HPLC)	Sigma Aldrich	Zobacz materiał T7883	Rozpuścić w 100% (bezwzględnym) etanolu
Amfoterycyna	Amresco (Astralny Naukowy)	E437-100MG	Rozpuścić w wodzie dejonizowanej
Bacytracyna z Bacillus licheniformis	Sigma Aldrich	Zobacz materiał B0125	Rozpuścić w wodzie dejonizowanej
Kwas naladiksowy	Sigma Aldrich	Numer katalogowy N8878	Rozpuścić w wodzie dejonizowanej
Sprzęt i wyroby z tworzyw sztucznych
Oxoidowe słoiki anaerobowe	Thermo Fischer Naukowy	HP0011/HP0031
COPAN Pipety Pasteura	Usługi Interpath	Zobacz materiał 200CS01
Wirówka Eppendorf 5810R			Zbieranie granulek bakteryjnych przez odwirowanie z prędkością 2 200 obr./min przez 10 minut w temperaturze 4°C
Parafilm M	Bemis, VWR	Zobacz materiał PM996
Eppendorf mikrotłuczek do probówek 1,2 - 2 ml	Sigma Aldrich	Z317314	Tłuczki polipropylenowe do sterylizacji w autoklawie używane do homogenizacji żołądka
Dysocjator GentleMACs	Miltenyi Biotec	130-093-235	Użyj wstępnie ustawionych programów gentleMACS dla tkanki żołądka myszy
M Rurki (pomarańczowa nasadka)	Miltenyi Biotec	Nr tel. 30-093-236
Fluorometr kubitowy	Thermo Fischer Naukowy	Q33216
Sterylna plastikowa pętelka	LabServ	LBSLP7202