$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie cewników
- Przygotuj jedną pediatryczną kaniulę o dostępie dożylnym dla każdej grupy myszy, która ma zostać zakażona. Korzystając z wbudowanego mechanizmu sprężynowego, odłącz każdą kaniulę od igły, zgodnie z instrukcją producenta. Wyrzuć igły, zachowując tylko plastikową kaniulę dożylną.
- Sterylizuj cewniki w kapturze z przepływem laminarnym przez jeden cykl ultrafioletowy (UV), zwykle 25 - 30 min.
Uwaga: Cewniki mogą być używane dla więcej niż jednej myszy, jednak nowy cewnik powinien być używany między grupami eksperymentalnymi, płciami lub szczepami bakterii.
2. Przygotowanie uropatogennej E. coli do infekcji
- Co najmniej dwa dni przed zakażeniem, używając sterylnej pętli do zaszczepiania, rozprowadź UPEC z zamrożonego wywaru bakteryjnego na płytce agarowej Luria Bulion (LB), zawierającej antybiotyki, jeśli to konieczne. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. Talerze można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia.
- W sterylnej kolbie Erlenmeyera o pojemności 100 ml zaszczepić 10 ml LB, zawierającej antybiotyki, jeśli to właściwe, pojedynczą kolonią z płytki LB i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc (około 16-18 godzin).
Uwaga: Stałe kultury bakterii pozwalają na ekspresję pilusów typu 1, które są niezbędne do zakażenia. Kultury wyhodowane w potrząśnięciu będą miały mniej wydajną ekspresję pilusów, a tym samym niespójne wskaźniki infekcji.
- Zmierzyć gęstość optyczną (OD)600 w nocnej hodowli i obliczyć liczbę bakterii na ml, korzystając z wcześniej ustalonej krzywej wzrostu. Na przykład dla szczepu UPEC UTI89, OD600 = 0,35 odpowiada 2 x 108 CFU na ml, a zatem hodowla przez noc z OD600 = 2,4 byłaby równoważna 13,7 x 108 CFU na ml. Empirycznie określ związek między OD600 a żywymi bakteriami z każdym nowym szczepem wykorzystywanym do infekcji.
- Określ potrzebną ilość bakterii, biorąc pod uwagę liczbę zwierząt, które mają zostać zakażone i że każda mysz powinna otrzymać około 107 jednostek tworzących kolonie (CFU) w 50 μl PBS. Uwzględnij w obliczeniach ~130 μl martwej objętości cewnika i wypustki strzykawki oraz 100 μl potrzebnych do określenia inokulum.
- Wirować zawiesinę bakteryjną w mikrowirówce stołowej o sile 17 000 x g przez 1 minutę i ponownie zawiesić powstałą osadkę bakteryjną w ilości 2 x 108 jtk/ml w PBS. Seryjnie rozcieńczyć porcję tej zawiesiny i ułożyć ją na płytkę na agarze LB, w razie potrzeby z antybiotykami, w celu określenia dokładnego inokulum dla każdego zakażenia.
- Narysuj inokulum bakteryjne do strzykawki o pojemności 1 ml i przymocuj cewnik do końca strzykawki. Postukać w strzykawkę, aby usunąć powietrze i wcisnąć tłok, aby wypełnić martwą przestrzeń powietrzną w cewniku przed rozpoczęciem wkraplania.
3. Przygotowanie myszy
- Znieczulenie myszy poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie 100 mg/kg ketaminy i 5 mg/kg ksylazyny. Można zapewnić dodatkowe ciepło.
- Upewnij się, że każda mysz jest w pełni uspokojona, ściskając podnóżek ze średnim naciskiem. Myszy są w pełni uspokojone, gdy nie reagują i potrzebują 3 - 5 minut, aby osiągnąć ten stan.
- Ułóż myszy na wznak i wywieraj średni nacisk na dolną część brzucha, aby opróżnić pęcherz z moczu. Pełne pęcherze są jak ziarnko grochu pod skórą między grzebieniami biodrowymi.
Uwaga: Wziewny izofluran był używany do cewnikowania samic myszy, jednak nie przetestowano, czy samce myszy są wystarczająco znieczulone wziewnym izofluranem do tej procedury.
4. Wkraplanie przezcewkowe samcom myszy
- Przyłóż dwa kleszcze do kciuków czaszkowo i doogonowo do zewnętrznych narządów płciowych myszy. Cofnij napletek, aby w pełni odsłonić żołądź prącia. Gdy penis znajdzie się na zewnątrz, zwolnij kleszcze kciuka.
- Zmień położenie kleszczy, aby ustabilizować wystającego penisa prostopadle do zwierzęcia, przytrzymując narząd delikatnie, ale mocno. Uwidocznij ujście cewki moczowej i ostrożnie wprowadź cewnik do małego otworu na końcu narządu. Delikatnie wprowadź cewnik do penisa, w kierunku ciała myszy, utrzymując delikatne napięcie kleszczami. Cewnik nie wymaga smarowania. Nie wciskaj cewnika na siłę do penisa; Cewnik powinien płynnie wsunąć się do cewki moczowej, wskazując prawidłowe umieszczenie.
- Gdy piasta cewnika zetknie się z czubkiem prącia, bardzo powoli dozuj 50 μl inokulum, zachowując pozycję prącia. Jakość wkraplania można w tym czasie odnotować zgodnie z wcześniej ustaloną oceną jakości wkraplania, taką jak pokazana na rysunku 1.
- Wycofaj cewnik powoli, powyżej liczby 5, aby zapobiec wyciekowi inokulum. Umieść myszy w klatkach w pozycji leżącej. Zwierzęta powinny zacząć wracać do zdrowia po 30 - 45 minutach od podania środka znieczulającego.
