$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury związane z modelami zwierzęcymi zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
1. Analiza cytometryczna przepływu tkanki pęcherza moczowego
- Przygotować bufor do wytrawiania zawierający kolagenazę w stężeniu 34 jednostek/ml i DNazę w stężeniu 100 μg/ml w PBS. Trzymaj na lodzie. Przygotować jedną stożkową probówkę o pojemności 15 ml na zwierzę do analizy i podamy 1 ml buforu do wytrawiania na probówkę.
- W określonych punktach czasowych należy złożyć ofiary myszy przy użyciu zatwierdzonych standardowych procedur operacyjnych (np. zwichnięcie szyjki macicy lub przedawkowanie dwutlenku węgla). Dokładnie zwilż brzuch 70% etanolem, aby zminimalizować zanieczyszczenie sierścią.
- Wykonaj nacięcie w poprzek dolnej jednej trzeciej brzucha myszy o długości co najmniej 2 cm za pomocą nożyczek i usuń cały pęcherz. Dobrze zmiel nożyczkami, krojąc pęcherz na 2 - 3 mm kawałki wielkości2, zwykle około 8 sztuk.
- Dodać jeden zmielony pęcherz do probówki zawierającej bufor wytrawiający. Wstrząśnij, aby przemyć zmieloną tkankę pęcherza moczowego do buforu do wytrawiania. Trzymaj na lodzie, aż wszystkie pęcherze zostaną wycięte i zmielone.
- Inkubować rozdrobnione pęcherze przez 60 - 75 minut w temperaturze 37 °C, energicznie potrząsając ręką przez 5 s co 15 minut. Kiedy tkanka ma szklisty, przezroczysty wygląd, przypominający mokrą bibułkę, trawienie jest zakończone. Przedłużone trawienie usunie białka powierzchniowe z komórek potrzebnych do identyfikacji i należy tego unikać.
- Dezaktywować enzymy trawiące przez dodanie 2 - 3 ml lodowatego buforu cytometrii przepływowej (PBS zawierający 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 0,2 mM EDTA) i delikatnie wymieszać. Umieść probówki na lodzie.
- Aby zapewnić zawiesinę jednokomórkową i usunąć tkankę łączną, przepuścić zawartość probówki przez filtr 100 μm umieszczony w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Delikatnie przecisnąć pozostałą tkankę przez filtr końcem tłoka strzykawki. Przemyć filtr dodatkowym buforem do cytometrii przepływowej o pojemności 2 ml. Próbki należy przechowywać na lodzie.
- Przemywać próbki przez odwirowanie przez 7 minut w temperaturze 200 x g, 4 °C. Zawiesić osady w 100 μl buforze cytometrii przepływowej zawierającym blok Fc, rozcieńczonym do 5 μg/ml i przenieść na 96-dołkową okrągłą płytkę denną. Po 10 - 15 minutach dodaj 100 μl pożądanego koktajlu przeciwciał do każdej próbki. Próbki inkubować przez 30 - 45 minut, na lodzie, chronić przed światłem.
nuta: Blok Fc jest odczynnikiem stosowanym w celu zapobiegania wiązaniu się części Fc przeciwciał z komórkami eksprymującymi receptory Fc. Jego celem jest zminimalizowanie nieswoistego wiązania przeciwciał. Określenie przeciwciał do użycia będzie zależało od hipotezy testowanej w eksperymencie i powinno być wybrane na podstawie danych z literatury. Na rycinie 1, aby zmierzyć ogólny naciek komórek odpornościowych, zastosowano przeciwciało anty-CD45, które jest białkiem komórek panimmunologicznych.
- Przemywać próbki przez odwirowywanie przez 7 minut w temperaturze 200 x g, 4 °C. Ponownie zawiesić granulki komórek w buforze do cytometrii przepływowej o pojemności 200 μl i przepuścić próbki przez sitko o wielkości 40 μm na probówce z polistyrenu o pojemności 5 ml tuż przed pobraniem na cytometr przepływowy.
- Pobrać całą próbkę na cytometr przepływowy. Dobre trawienie da 200 000 - 400 000 komórek, z 8 000 - 10 000 komórek odpornościowych CD45 + z naiwnych pęcherzy myszy, podczas gdy zainfekowane narządy będą zawierały więcej komórek (ryc. 1).
nuta: Próbki przygotowane do analizy metodą cytometrii przepływowej nie mogą być wykorzystywane do oceny CFU. Nie zaleca się dzielenia pęcherza moczowego na dwie części, ponieważ nie ma dowodów na to, że uropatogenna kolonizacja E. coli (UPEC) lub infiltracja komórek odpornościowych jest jednolita w całej tkance.
