Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
UWAGA: Praca z próbkami ludzkiej krwi i ludzkimi pasożytami malarii wymaga środków ostrożności. Zawsze noś fartuch laboratoryjny i rękawice oraz pracuj w komorze bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2. W przypadku przypadkowego przezskórnego narażenia na malarię u ludzi należy zgłosić się do Ministerstwa Bezpieczeństwa i Higieny Pracy w celu leczenia profilaktycznego. Należy również uwzględnić dodatkowe względy bezpieczeństwa w przypadku pracy z ludzkim wirusem niedoboru odporności HIV(+) krwi. Załóż fartuch laboratoryjny z tyłu. Podwójna rękawica (górna rękawica powinna być lateksowa). Całą obsługę należy wykonywać w szafie bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2. Nie używaj szkła ani ostrych przedmiotów. Nie używaj aspiratora. Umieść wszystkie zanieczyszczone przedmioty w roztworze virox lub wybielaczu na co najmniej 1 godzinę przed wyrzuceniem. Umyj wszystkie powierzchnie wirusem virox i ultrafioletem (UV) przez 1 godzinę po użyciu. Należy pamiętać, że każda instytucja będzie miała swoje własne przepisy dotyczące bezpieczeństwa biologicznego, których należy przestrzegać. Zgłaszaj wszystkie przypadkowe narażenie na krew zakażoną wirusem HIV do działu zdrowia i bezpieczeństwa w celu oceny i rozważenia możliwej profilaktyki poekspozycyjnej.
Uwaga: Istnieją różne szczepy pasożytów malarii P. falciparum. Do tych eksperymentów użyto ITG, ale można użyć różnych szczepów. Doskonałe instrukcje dotyczące zamrażania i rozmrażania pasożytów Plasmodium falciparum są dostępne na stronie MR4.
1. Wytwarzanie RPMI-A dla hodowli pasożytów malarii
- Przygotować RPMI-0 mieszając 950 ml podwójnie destylowanej wody (ddH2O), 1 opakowanie proszku Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640, 6 g kwasu N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-2-etanosulfonowego (HEPES), 2 g wodorowęglanu sodu i 1,35 mg hipoksantyny.
- Rozmrozić inaktywowaną termicznie surowicę ludzką od dwóch różnych dawców. Dawcy AB są najlepsi, ale każdy może być użyty, jeśli pasożyty są hodowane w czerwonych krwinkach typu O (RBC). Odwróć probówki do wymieszania. Jeśli surowica zawiera cząstki stałe lub jest gęsta, wiruj z prędkością 2,000 obr./min, a następnie przefiltruj część płynną za pomocą jednostki filtrującej 0,45 μm.
- Za pomocą jednostki filtrującej 0,2 μm przefiltruj 180 ml RPMI-0, 20 ml ludzkiej surowicy (10 ml od każdego dawcy) i 0,5 ml 10 mg/ml gentamycyny.
nuta: Surowica ludzka może zatkać filtr, więc może być wymagana więcej niż jedna jednostka filtrująca.
- Oznacz pożywkę butelką RPMI-A, datą i źródłem surowicy. Wstaw do lodówki, aż będzie to potrzebne. RPMI-A może stać się mętny w lodówce. Jest to normalne, ale rosnące zachmurzenie jest oznaką zanieczyszczenia.
nuta: Wzrost pasożyta może się różnić w różnych surowicach dawcy. Dobrym pomysłem jest przetestowanie wszystkich partii surowicy ludzkiej pod kątem prawidłowego wzrostu pasożytów przed użyciem.
2. Przygotowanie ludzkich czerwonych krwinek do hodowli pasożytów
Uwaga: Dawcy krwi powinni być typu O.
- Zebrać 7-10 ml krwi do probówek z kwasem, cytrynianem i dekstrozą (ACD). Na etykiecie należy wpisać identyfikator dawcy i datę pobrania.
- Przechowywać krew w temperaturze 4 oC do czasu, gdy będzie potrzebna. Użyj krwi do hodowli pasożytów w ciągu 1 miesiąca.
- Przetrzyj górną część rurki 70% etanolem. Ostrożnie wyjąć korek i wyrzucić go. Przenieść krew do probówki o pojemności 15 ml. Wiruj przez 3 minuty przy 1,000 x g. Usuń osocze przez aspirację.
- Zawieś RBC z równą objętością ciepłego RPMI-0. Wirować przez 5 minut przy 1,000 x g. Usunąć kożuchową sierść przez aspirację, ponownie zamieszać w 5 ml RPMI-0 i powtórzyć pranie jeszcze 2 razy.
- Usunąć supernatant i dodać tyle RPMI-A, aby uzyskać mieszaninę o objętości 50% RBC.
- Przechowywać w temperaturze 4 oC do czasu, gdy będzie potrzebna.
3. Utrzymanie kultur pasożytów
- Wstępne rozgrzanie RPMI-A do 37 oC.
- Umieść rozmrożone pasożyty (patrz protokół MR4 dla procedury rozmrażania) w kolbie T25 z 5 ml RPMI-A i 75 μl przemytych ludzkich krwinek czerwonych, aby uzyskać hematokryt ~3%. nuta: Hematokryt mierzy objętość erytrocytów w porównaniu z objętością całkowitą. Aby obliczyć hematokryt, zmierz objętość upakowanych erytrocytów do całkowitej objętości pożywki plus RBC. Załóżmy, że rozmrożone pasożyty wniosą 75 μl erytrocytów. Dodając 150 μl bulionu RBC (co odpowiada dodaniu 75 μl upakowanych RBC) do kolby, otrzymujemy w sumie 150 μl RBC w 5 ml pożywki, co odpowiada hematokrytowi 3% (150 μl/5 000 μl x 100% = 3%).
- Gazować kolbę przez 30 sekund mieszaniną gazów pasożytniczych (1% O2 , 3 % CO2, bilans N2). Uszczelnić kolbę szeroką stroną do dołu w inkubatorze o temperaturze 37 o temperaturze 37 oC, tak aby zapewnić jak największą powierzchnię wymiany gazowej.
- Aby zmienić pożywkę i sprawdzić, czy nie ma parazytemii (należy to robić codziennie), ostrożnie przesuwaj kolbę, aby nie naruszyć warstwy RBC. Za pomocą sterylnej, odłączonej pipety Pasteura odciągnij pożywkę hodowlaną bez naruszania warstwy krwi.
- Aby sprawdzić parazytemię, usuń próbkę o objętości 10 μl z warstwy krwi, umieść ją na szkiełku podstawowym i za pomocą drugiego szkiełka utwórz cienki film krwi. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia.
- Umieścić 4 ml świeżego RPMI-A w kolbie, delikatnie wymieszać, gazować przez 30 sekund i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
- Zabarwić szkiełko za pomocą zestawu do barwienia Hema3 zgodnie z protokołem producenta.
- Aby uzyskać optymalne barwienie, zanurz szkiełka w roztworze utrwalającym na 10 sekund, roztworze I na 10 sekund i roztworze II na 30 sekund. Spłucz w wodzie i pozostaw szkiełka do wyschnięcia.
- Oblicz parazytemię, licząc liczbę Plasmodium falciparum RBC, PfRBC (zabarwiony na ciemnofioletowo) w porównaniu z całkowitą liczbą RBC (zabarwiony na różowo). Policz w sumie 300 komórek, aby zapewnić dokładność.
- Gdy pasożyty osiągną parazytemię na poziomie 5%, rozprowadź hodowlę do kolby T75, używając 40 ml RPMI-A i 500 μl RBC.
4. Synchronizacja pasożytów
Uwaga: Dzień przed eksperymentem zsynchronizuj hodowlę pasożytów, podając ją alaniną. Tylko pasożyty w stadium pierścieniowym i niezakażone erytrocyty przetrwają to leczenie. Synchronizacja alaniny zapewni Ci czystą kulturę trofozoitów następnego dnia, którą można wykorzystać w eksperymentach z kokulturą. Upewnij się, że zaczynasz od kultury pasożytów, która zawiera większość pasożytów w stadium pierścieniowym.
- Przygotować roztwór alaniny, mieszając 8,01 g alaniny (300 mM) i 0,365 g Tris (10 mM) z 300 ml ddH2O. Doprowadzić pH do 7,4. Filtr sterylizować za pomocą jednostki filtrującej 0,2 μm.
- Podgrzej roztwór alaniny do temperatury 37 oC.
- Odwiruj kulturę pasożyta (5 min x 1 000 x g) i usuń pożywkę.
- Zawiesić osad w 19 objętościach roztworu alaniny (1 ml napakowanych erytrocytów na 19 ml roztworu alaniny). Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT).
- Wirowanie 5 min x 1 000 x g. Aspirat supernatantu. Umyj raz w RPMI-0. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w RPMI-A i dostosować hematokryt do ~3%. Kolba gazowa i powrót do 37 oC.
nuta: W przypadku eksperymentów z kokulturą potrzebna jest minimalna parazytemia wynosząca 5% trofozoitów, przy czym 10% parazytemii jest uważane za optymalne.
5. Przygotowanie pasożytów i krwinek czerwonych do eksperymentów z kokulturą
- Użyj stosunku 3 PfRBC na PBMC w eksperymentach z kokulturą, aby wywołać reakcję zapalną. Aby obliczyć całkowitą liczbę PfRBC, należy określić ilościowo parazytemię, wykonując cienki rozmaz krwi, jak opisano w 3.5, a hematokryt, licząc liczbę erytrocytów na ml hodowli pasożyta za pomocą hemocytometru.
Liczba PfRBC = % parazytemii x całkowita liczba krwinek czerwonych/ml x ml hodowli. Na przykład 10 ml kultury przy 10 x 106 RBC/ml i 10% parazytemii jest równe 0,1 x 106 / ml x 10 ml = 10 x 10 6 PfRBC.
- Wiruj kulturę pasożyta przez 5 minut w temperaturze 1 000 x g (RT). Odessać pożywkę i ponownie zawiesić w stężeniach 6 x 106 PfRBC na ml w RPMI-S+ (500 ml RPMI-1640 uzupełniony L-glutaminą i HEPES, 10% inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca (FBS), 1,5 ml gentamycyny, 5 ml 100 mM pirogronianu sodu, 5 ml 10 mM aminokwasów endogennych MEM, 5 ml 5 mM β-merkaptoetanolu).
- Pobrać krew kontrolną (niezakażone erytrocyty od tego samego dawcy, który jest używany do utrzymania hodowli pasożyta), obliczyć hematokryt i ponownie zawiesić w RPMI-S+ przy tej samej liczbie krwinek czerwonych na ml, co hodowla pasożyta.
6. Izolacja ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC)
- Krew żylną należy pobrać w probówkach z heparyną sodową (zielona góra) zarówno od dawcy przewlekle zakażonego wirusem HIV(+), jak i od osoby z grupy kontrolnej HIV(-). Nie należy stosować kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) jako antykoagulantu, ponieważ chelatujące wapń działanie EDTA wpływa na funkcjonowanie komórek. Średnio spodziewaj się od 5-10 x 106 PBMC na 10 ml krwi. W typowym eksperymencie należy pobrać 30 ml krwi od każdego dawcy. Objętość krwi będzie musiała zostać dostosowana zgodnie z wymaganiami doświadczalnymi.
- Tak szybko, jak to możliwe, a na pewno w ciągu godziny od pobrania krwi, usuń krew z probówek i umieść ją w plastikowej probówce o pojemności 50 ml. W szczególności monocyty zostaną aktywowane i przykleją się do szkła, dlatego ważne jest, aby w przypadku użycia szklanych probówek do pobierania krwi komórki były usuwane tak szybko, jak to możliwe.
- Wiruj krew o sile 1000 x g przez 15 minut i zbierz osocze (w razie potrzeby można to wykorzystać do innych badań – jeśli nie, ten krok można pominąć). Rozcieńczyć krew w równej objętości zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco.
- Umieścić 15 ml RT Ficoll w probówce o pojemności 50 ml. Powoli, za pomocą sterylnej plastikowej pipety do przenoszenia, nałóż roztwór krwi/DPBS na Ficoll bez mieszania. Na każde 15 ml Ficollu można nałożyć maksymalnie 25 ml roztworu krew/DPBS.
- Obracaj gradienty przez 30 minut przy RT przy 600 x g. Upewnij się, że ustawienie "bez hamulca" jest włączone.
- Gdy komórki się obrócą, poszukaj interfejsu między dwiema fazami. To jest miejsce, w którym znajdują się PBMC. Za pomocą sterylnej plastikowej pipety transferowej pobrać PBMC z granicy faz (patrz rysunek 1). Minimalizacja zanieczyszczenia przez RBC.
- Zebrane komórki umieścić w probówkach o pojemności 50 ml, nie więcej niż 20 ml na probówkę. Górna probówka do 50 ml ze sterylnym zimnym DPBS.
- Wirować komórki przez 10 minut w temperaturze 4 oC i 300 x g.
- Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad w 5 ml sterylnego zimnego DPBS i zebrać wszystkie komórki od tego samego dawcy w jednej probówce. Uzupełnij do 50 ml sterylnym DPBS i powtórz kroki prania jeszcze 2 razy.
- Zawieś komórki w 10 ml pożywki RPMI-S+.
- Usunąć podwielokrotność o objętości 20 μl i wymieszać z 20 μl błękitu trypanowego. Odpipetować 10 μl do hemocytometru i policzyć żywe komórki (komórki, które nie wchłonęły niebieskiego barwnika – wszystkie niebieskie komórki są martwe). Użyj hemocytometru, aby obliczyć liczbę komórek w roztworze w następujący sposób.
nuta: Hemocytometr ma siatkę o określonych wymiarach, dzięki czemu znany jest obszar pokryty liniami.
- Upewnij się, że hemocytometr jest czysty. Umieść szkiełko nakrywkowe na obszarze liczenia. Załadować 10 μl roztworu komórkowego, umieszczając końcówkę pipety w jednym z dołków w kształcie litery V. Obszar pod szkiełkiem nakrywkowym zostanie wypełniony działaniem kapilarnym.
- Umieść załadowany hemocytometr pod mikroskopem. Pełna siatka hemocytometru zawiera 9 kwadratów o średnicy 1 mm2 każdy. Policz wszystkie komórki w każdym dużym kwadracie. Jeśli obecnych jest zbyt wiele komórek, rozcieńczyć roztwór i ponownie przeliczyć.
- Oblicz stężenie komórek w następujący sposób: Całkowita liczba komórek/ml = (całkowita liczba komórek/# kwadratów) x współczynnik rozcieńczenia x 10 000 komórek/ml, np. (500 komórek/5 kwadratów) x współczynnik rozcieńczenia 20 x 10 000 komórek/ml = 20 x 10 łącznie6 komórek.
- Doprowadzić pożywkę do końcowego stężenia 10 x 106 na ml (pożywka RPMI-S+).
7. Kultura jednoczesnego zakażenia malarią/HIV
- Płytka 100 μl izolowanych PBMC i 400 μl pożywki RPMI-S+ na płytkę 24-dołkową (1 x 106 PBMC na studzienkę). Upewnij się, że studzienki są ustawione w trzech egzemplarzach: 3 dołki dla niezakażonych RBC, 3 dołki z PfRBC, 3 dołki z pożywką i 3 dołki z PMA/jonomycyną. Dotyczy to zarówno próbek HIV(+), jak i HIV(-).
- W przypadku studzienek PfRBC umieścić 3 x 106 PfRBC w każdym z dołków (500 μl kultury pasożytów przygotowanej w 5.2).
- W przypadku studzienek niezakażonych krwinek czerwonych należy umieścić po 500 μl niezakażonej kultury krwinek czerwonych przygotowanej w ppkt 5.3 w każdym z dołków.
- W przypadku dołków pośrednich należy umieścić 500 μl pożywki RPMI-S+ w każdej z pożywki.
- W przypadku studzienek PMA/jonomycyny należy przygotować roztwór PMA/jonomycyny (odpowiednio 2,5 pg/ml, 250 pg/ml). Umieść 500 μl tego roztworu w każdym dołku.
nuta: Jako silne stymulatory wydzielania cytokin limfocytów T, PMA i jonomycyna są stosowane jako kontrole pozytywne w celu zapewnienia funkcjonowania komórek.
- Umieścić płytkę w temperaturze 37 oC w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
- Opcjonalnie: użyj nadmiaru komórek do analizy fenotypowej za pomocą cytometrii przepływowej lub przechowuj je w roztworze stabilizującym RNA do przyszłej analizy ekspresji mRNA.
8. Wykrywanie odpowiedzi immunologicznej na malarię
Uwaga: Przeprowadzaj eksperymenty z kulturą przez 4 dni. W tym czasie nie jest wymagana wymiana podłoża. Optymalny punkt czasowy będzie zależał od typu interesującej komórki i zadanego pytania. Inkubacja trwająca 12-48 godzin jest optymalna dla monocytowych odpowiedzi na PfRBC, podczas gdy odpowiedzi limfocytów najlepiej obserwowano po 72-96 godzinach. Punkty czasowe będą musiały zostać zoptymalizowane na podstawie pytania eksperymentalnego. Krótsze okresy (2-4 godziny) mogą być stosowane, jeśli interesująca jest interakcja między nienaruszonymi PfRBC a PBMC.
- Obracaj płytkę o gramaturze 300 x g przez 3 minuty, aby ogarnąć komórki. Zbierz 700 μl supernatantu kulturowego z każdej studzienki.
- Wirować supernatant o masie 1 000 x g przez 5 minut, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.
- Podwielokrotność oczyszczonego supernatantu w razie potrzeby oznaczyć i zamrozić w temperaturze poniżej -20 °C do czasu przeprowadzenia analizy wydzielanych czynników.
