Indukcja choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi w modelach mysich za pomocą allogenicznego przeszczepu szpiku kostnego i komórek śledziony

Streszczenie

Źródło: Buchele, V., et al. Indukcja choroby przeszczep jelitowy przeciwko gospodarzowi i jej mini-endoskopowa ocena u żywych myszy. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film demonstruje indukcję choroby jelitowej przeszczep przeciwko gospodarzowi, GvHD, u śmiertelnie napromieniowanej myszy biorcy przy użyciu allogenicznych hematopoetycznych komórek macierzystych i indukujących GvHD alloreaktywnych limfocytów T indukujących śledzionę. Protokół ten pomaga w ustaleniu modelu ciężkiej ostrej choroby jelitowej GvHD, aby zrozumieć mechanizm choroby i opracować innowacyjne opcje terapeutyczne.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Indukcja GvHD

1. Dzień 0: Napromienianie całego ciała myszy biorcy
   1. Jako biorców należy użyć samic myszy CD45.2+ H2kd+ BALB/c, które mają co najmniej 10 tygodni.
   2. Zważ i zapisz wagę myszy biorcy przed indukcją GvHD.
      nuta: Upewnij się, że odbiorca ma minimalną masę ciała wynoszącą 20 g. Wyjściowa masa ciała posłuży jako wartość referencyjna do obliczenia utraty masy ciała przez pojedynczą mysz w trakcie indukcji i progresji GvHD.
   3. Umieść do pięciu myszy w pojemniku promiennika rentgenowskiego.
   4. Napromienić myszy przez napromieniowanie całego ciała pojedynczą dawką 8 Gy promieniowania rentgenowskiego. Użyj Cs137 jako źródła promieniowania.
2. Dzień 1: Rekonstytucja napromienianych myszy ze szpikiem kostnym zubożonym w limfocyty T
   nuta: Przeszczepienie allogenicznych komórek szpiku kostnego, zgodnie z opisem i szczegółami w punkcie 1.2, powinno odbyć się w ciągu 24 godzin po napromienianiu. Wykonaj opisane poniżej procedury w sterylnym kapturze do hodowli tkanek i użyj przefiltrowanych odczynników. Użyj allogenicznego CD45.1/Ly5.1 B6. Myszy SJL-Ptprca Pepcb / BoyCrl jako dawcy szpiku kostnego zubożonego w limfocyty T.
   1. Eutanazja CD45.1/Ly5.1 B6. Myszy SJL, które oddadzą allogeniczne komórki szpiku kostnego zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi, 12-24 godziny po napromieniowaniu myszy biorcy BALB/c. W tym celu znieczulij CD45.1/Ly5.1 B6. Myszy SJL przez inhalację 5% izofluranu. Kontynuuj ekspozycję na izofluran przez 1 minutę po zatrzymaniu oddechu i potwierdź eutanazję przez zwichnięcie szyjki macicy.
   2. Dokładnie zdezynfekuj sierść i skórę myszy 70% etanolem.
   3. Umieść mysz na czystej osłonie roboczej, tak aby mysz znajdowała się w pozycji leżącej, z tylnymi kończynami skierowanymi w stronę eksperymentatora. Podnieś futro na pięcie achillesowej za pomocą końcówki kleszczy Semken o długości 13 cm i ząbkowanych zakrzywionych końcówkach. Naciąć skórę między kleszczami a piętą utwardzonymi cienkimi nożyczkami o długości 8,5 cm z prostymi końcówkami.
   4. Wydłuż nacięcie czaszkowo (tj. od pięty przez dolną część nogi i udo do okolicy bioder). Usuń skórę i sierść z tylnej kończyny za pomocą kleszczy.
   5. Wykonaj tę samą procedurę na drugiej tylnej kończynie.
   6. Usuń tylne kończyny, przecinając sąsiednie stawy biodrowe.
   7. Odetnij tylne łapy. Przeciąć staw kolanowy. Udo i trzon każdej kończyny tylnej przechowywać razem na szalce Petriego o średnicy 92 mm wypełnionej roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na lodzie.
   8. Dokładnie oczyść kości udowe i piszczelowe, usuwając jak najwięcej tkanki mięśniowej z każdego uda i podudzia. Przenieś kości udowe i piszczelowe do probówki o pojemności 50 ml wypełnionej sterylnym podłożem RPMI 1640 i umieść ją na mokrym lodzie, aż wszystkie kości piszczelowe i udowe zebrane w kroku 1.2.7 zostaną oczyszczone z tkanki mięśniowej.
   9. Aby wyizolować szpik kostny, należy przenieść jedną kość udową lub piszczelową na raz (która została oczyszczona w sposób opisany w kroku 1.2.8) z probówki o pojemności 50 ml na szalkę Petriego (o średnicy 92 mm) wypełnioną pożywką RPMI 1640. Odetnij końce kości udowej lub piszczelowej skalpelem, aby uzyskać dostęp do jamy kości zawierającej szpik kostny.
   10. Przygotować probówkę zbiorczą o pojemności 50 ml z 5 ml pożywki RPMI 1640. Wprowadzić igłę 26 G dołączoną do strzykawki o pojemności 1 ml wypełnionej 1 ml pożywki RPMI 1640 do jamy kostnej i wypłukać szpik kostny z jamy do probówki zbiorczej, naciskając tłok.
   11. Powtarzaj krok 1.2.10, aż kość stanie się jasna i błyszcząca (tj. jama kostna będzie widocznie pozbawiona czerwonawego szpiku kostnego). Wyrzuć pustą kość.
   12. Powtórz kroki 1.2.9 - 1.2.11, używając wszystkich kości udowych i piszczelowych z kroku 1.2.8 i zbierz wszystkie odzyskane kawałki szpiku kostnego do tej samej probówki o pojemności 50 ml z kroku 1.2.10. Probówkę do pobierania próbek należy przechowywać na mokrym lodzie do czasu, aż wszystkie kości z kroku 1.2.8 zostaną odpowiednio przetworzone.
   13. Zawiesinę jednokomórkową należy stworzyć, delikatnie pipetując przepłukane, kruche kawałki szpiku kostnego w górę i w dół. Przefiltrować zawiesinę jednokomórkową szpiku kostnego przez siatkowy sitko o wielkości 40 μm umieszczone na nowej probówce zbiorczej o pojemności 50 ml.
   14. Odwirować probówkę zbiorczą o pojemności 50 ml zawierającą zawiesinę jednokomórkową szpiku kostnego o sile 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
   15. Zawiesić osad w 5 ml buforu lizującego ACK (1 mM Na²EDTA; 10 mM KHCO₃; 144 mM NH₄Cl; pH 7,2) w celu lizy czerwonych krwinek. Inkubować zawiesinę komórkową przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Następnie natychmiast dodaj 10 ml roztworu PBS do zawiesiny komórek.
   16. Odwirować zawiesinę o stężeniu 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 ml roztworu PBS.
   17. Policz komórki szpiku kostnego za pomocą hemocytometru. Zachować podwielokrotność 6 x 10⁶ komórek do analizy metodą cytometrii przepływowej w celu sprawdzenia czystości komórek po oczyszczeniu komórek (patrz krok 1.2.20).
   18. W celu zmniejszenia ilości limfocytów T w zawiesinie jednokomórkowej szpiku kostnego należy użyć dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania komórek. Magnetycznie zubożyć komórki CD90.2+ (tj. limfocyty) z całkowitej liczby komórek szpiku kostnego, postępując zgodnie z protokołem producenta.
   19. Policz komórki szpiku kostnego zubożone w limfocyty T, które zostały wyizolowane zgodnie z opisem w kroku 1.2.18, za pomocą hemocytometru. Zachować podwielokrotność 1 x 106 komórek do analizy cytometrii przepływowej, która ma być przeprowadzona później, jak opisano w kroku 1.2.20.
       nuta: Średnia wydajność komórek pochodząca od jednej myszy dawcy wynosi zwykle od 2 x 107 do 3,4 x 107 komórek szpiku kostnego zubożonych w limfocyty T.
   20. Potwierdź pomyślne wyczerpanie limfocytów T za pomocą cytometrii przepływowej. Zabarwić 1 x 10⁶ komórek, zakonserwowanych z etapów 1.2.17 (komórki szpiku kostnego przed magnetycznym oddzieleniem komórek) i 1.2.19 (komórki szpiku kostnego zubożone w limfocyty T po magnetycznym oddzieleniu komórek), następującymi przeciwciałami: α-CD45.1 (A20), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) i α-CD8α (53-6,7). Użyj pozostałych komórek z kroku 1.2.17 jako niebarwionej kontroli i do kontroli pojedynczego barwienia, aby skonfigurować cytometr przepływowy.
       1. Przenieść 1 x 10⁶ komórek z każdej próbki do dołka na 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery V, aby przeprowadzić procedurę barwienia metodą cytometrii przepływowej.
       2. Odwirować komórki w 96-dołkowej płytce (etap 1.2.20.1) w temperaturze 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl buforu FACS (PBS uzupełniony 3% przefiltrowaną surowicą bydlęcą).
       3. Odwirować komórki znajdujące się na 96-dołkowej płytce przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
       4. Dodać odpowiednią ilość wybranego przeciwciała (porównać z krokiem 1.2.20) do próbek do pojedynczego barwienia w 100 μl buforu FACS.
       5. Przygotować mieszaninę wszystkich przeciwciał (mieszanina wzorcowa) zawierającą odpowiednie ilości wystarczające do oddzielnego wybarwienia podwielokrotności komórek szpiku kostnego zachowanych po wcześniejszym (patrz etap 1.2.17) i po (patrz etap 1.2.19) wyczerpaniu magnetycznych limfocytów T. Dodać 100 μl mieszanki wzorcowej do obu podwielokrotności.
       6. Do niebarwionej próbki dodać tylko 100 μl buforu FACS.
       7. Inkubować komórki na 96-dołkowej płytce przez 20 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
       8. Dodać 100 μl buforu FACS i odwirować komórki znajdujące się na 96-dołkowej płytce o sile 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl buforu FACS.
       9. Odwirować komórki przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 250 μl buforu FACS.
       10. Przenieść próbki do probówki okrągłodennej z polistyrenu o pojemności 5 ml i przeanalizować je za pomocą cytometru przepływowego, który jest w stanie wykryć cząsteczki fluorescencyjne, które zostały użyte do znakowania przeciwciał użytych do scharakteryzowania próbek komórek (patrz krok 1.2.20).
       11. Porównaj skład komórek przed i po magnetycznym rozdzieleniu komórek.
           nuta: Zwykle uzyskuje się czystość około 95% komórek CD45.1 + CD3- (tj. szpiku kostnego zubożonego w limfocyty T) w żywej bramie.
   21. Przemyć zawiesiny komórek szpiku kostnego zubożone w limfocyty T 2x roztworem PBS (450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C), a na koniec ponownie zawiesić komórki w roztworze PBS, dostosowując stężenie komórek do 5 x 10 7 komórek/ml. Komórki należy trzymać na mokrym lodzie do czasu wstrzyknięcia.
   22. Należy wstrzyknąć komórki szpiku kostnego zubożone w limfocyty T myszom biorcom, które zostały napromienione dzień wcześniej (patrz punkt 1.1).
       1. Umieść eksperymentalną mysz w szczelnej komorze i wywołaj znieczulenie poprzez wdychanie do 4% izofluranu, aż mysz straci przytomność. Potwierdź analgezję i utratę przytomności, badając utratę odruchu prostowania i późniejszą utratę odruchu wycofania pedału.
       2. Wstrzyknąć 5 x 10⁶ komórek szpiku kostnego zubożonych w limfocyty T (tj. 100 μl z 5x10⁷ komórek/ml) zawierających roztwór PBS za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę 30 G dożylnie do przestrzeni zagałkowej zawierającej zatokę żylną.
3. Dzień 2: Transfer limfocytów T<br /> nuta: Wykonaj opisane poniżej procedury w sterylnym kapturze do hodowli tkanek i użyj przefiltrowanych odczynników. Użyj CD45.2 C57Bl/6 (typ dziki; WT) myszy jako dawcy alloreaktywnych limfocytów T. Zastosowanie systemów markerów kongenicznych pozwala na rozróżnienie typów komórek krwiotwórczych biorcy (myszy CD45.2+ H2kd+ Balb/c) i dawcy (komórki szpiku kostnego: CD45.1+ H2kb+ B6). myszy SJL; allogeniczne limfocyty T: myszy CD45.2 + H2kb + C57 / Bl6).
   1. Poddaj eutanazji myszy C57Bl/6 zgodnie z obowiązującymi wytycznymi i władzami instytucjonalnymi. Dlatego myszy należy znieczulać przez inhalację o stężeniu 5% izofluranu. Kontynuuj ekspozycję na izofluran do 1 minuty po zatrzymaniu oddechu i potwierdź eutanazję przez zwichnięcie szyjki macicy. Dokładnie zdezynfekuj sierść i skórę myszy 70% etanolem.
   2. Umieść sitko z sitkiem o oczkach 40 μm na probówce zbiorczej o pojemności 50 ml. Usuń śledzionę i umieść ją na sitku.
   3. Za pomocą tłoka strzykawki rozdrobnić śledzionę w sitku. Umyć sitko i tłok strzykawki PBS, aby zebrać wszystkie splenocyty.
   4. Odwirować komórki w probówce zbiorczej o pojemności 50 ml przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad.
   5. Ponownie zawiesić splenocyty w 3 ml buforu lizującego ACK w celu lizy czerwonych krwinek. Inkubować zawiesinę komórkową przez 3 minuty. Następnie dodać 10 ml PBS i odwirować komórki przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić splenocyty w PBS.
   6. Policz komórki śledziony za pomocą hemocytometru. Przekierować podwielokrotność 6 x 10⁶ komórek do analizy cytometrii przepływowej, aby ocenić wielkość oczyszczania w kroku 1.3.9.
   7. Aby uzyskać całkowitą izolację limfocytów T CD3 + z całkowitej liczby splenocytów, użyj dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania komórek. Wyizolować limfocyty T śledziony, postępując zgodnie z protokołem producenta.
   8. Policz limfocyty T CD3 + śledziony wyizolowane zgodnie z opisem w kroku 1.3.7 za pomocą hemocytometru. Zachować podwielokrotność 1 x 10⁶ limfocytów T do analizy cytometrii przepływowej.
      nuta: Średnia wydajność limfocytów T śledziony na mysz dawcę wyizolowaną przez magnetyczną separację komórek waha się od 1,3 x 10⁷ do 2 x 10⁷ komórek.
   9. Potwierdź powodzenie izolacji limfocytów T za pomocą cytometrii przepływowej. Aby uzyskać szczegółowy opis protokołu barwienia, zapoznaj się z krokami 1.2.20.1 - 1.2.20.10.
      1. Wybarwić 1 x 10⁶ splenocytów w krokach 1.3.6 (przed magnetycznym oddzieleniem komórek) i 1.3.8 (po magnetycznym oddzieleniu komórek) następującymi przeciwciałami: α-CD45.2 (104), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) i α-CD8α (53-6,7).
      2. Pozostałe komórki z kroku 1.3.6 należy wykorzystać jako niebarwioną kontrolę i do pojedynczego barwienia odpowiednimi przeciwciałami, aby ustawić cytometr przepływowy.
      3. Porównaj skład komórek przed i po magnetycznym oddzieleniu komórek.
         nuta: Należy osiągnąć czystość ≥95% limfocytów T CD45.2 + CD3 + w żywej bramie limfocytów.
   10. Przemyć limfocyty T 2x PBS (450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C) i na koniec ponownie zawiesić komórki w roztworze PBS, dostosowując stężenie komórek do 7 x 10⁶ komórek/ml. Komórki należy przechowywać na lodzie do momentu wstrzyknięcia.
   11. Wstrzyknąć alloreaktywne limfocyty T śledziony (patrz krok 1.3.10) napromieniowanym myszom BALB/c, które wcześniej otrzymały komórki szpiku kostnego zubożone w limfocyty T CD45.1 + (patrz krok 1.2.22).
       1. Wywołaj znieczulenie, umieszczając eksperymentalną mysz w szczelnej komorze, w której jest ona narażona na działanie do 4% izofluranu, aż straci przytomność. Potwierdź analgezję i utratę przytomności, badając utratę odruchu prostowania i późniejszą utratę odruchu wycofania pedału.
       2. Wstrzyknąć 0,7 x 10⁶ alloreaktywnych limfocytów T CD3+ za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę 30 G (tj. 100 μl z 7 x 10⁶ komórek/ml) zawierającą roztwór PBS (patrz krok 1.3.10), dożylnie do przestrzeni zagałkowej myszy, w celu wywołania GvHD. Oznacz te myszy jako grupę eksperymentalną.
       3. Wstrzyknij innej grupie myszy 100 μl samego PBS dożylnie do przestrzeni zagałkowej i oznacz tę grupę jako grupę kontrolną, zwaną następnie "myszami bez przeszczepu komórek T (noT)".

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Promiennik promieniowania gamma BIOBEAM 2000	Gamma-Service Meical GmbH
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Sigma-Aldrich Co., Sp. z o.o.	D8662-6x500ML
Kleszcze Semken (długość: 13 cm; ząbkowane, zakrzywione końcówki)	Narzędzia naukowe	11009-13
Hartowane nożyczki drobne (długość: 8,5 cm; końcówki proste; krawędź tnąca: 24 mm)	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 14090-09
RPMI-1640 Średni	Sigma-Aldrich Co., Sp. z o.o.	Czynnik chłodniczy R8758-500ML
Igła podskórna (26G)	B. Braun Melsungen AG	4657683
Strzykawka 1 ml	B. Braun Melsungen AG	9166017V
Probówka 50 ml	Sarstedt Ag & Co.KG	6,25,47,254
Sitko do komórek z siatką 40 μm	BD Sokół	Numer telefonu 352340
Strzykawka insulinowa ze sterylnym wnętrzem (30G)	Bd	324826
Zestaw do izolacji komórek Pan T II, mysz	Miltenyi Biotec GmbH	Numer katalogowy: 130-095-130	Separacja komórek magnetycznych w celu wyizolowania limfocytów T śledziony
CD90.2 Mikrokulki MicroBeads, mysz	Miltenyi Biotec GmbH	Numer katalogowy: 130-049-101	magnetyczna separacja komórek w celu wyizolowania komórek szpiku kostnego zubożonych w limfocyty T
Kleszcze do biopsji	KARL STORZ SE &Co KG	61071 ZJ	Część zestawu doświadczalnego do kolonoskopii
Sól disodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego, dwuwodna (Na2EDTA)	Carl Roth GmbH & Co.KG	8043.2	składnik buforu lizującego ACK
Przeciwciało anty-mysie CD45.2 Alexa Fluor 700 (klon: 104; partia: B252126; RRID: AB_493731)	Legenda biologiczna	109822
PE/Cy7 przeciwciało anty-mysie CD45.1 (klon: A20; partia: B217246; RRID: AB_1134168)	Legenda biologiczna	Numer katalogowy: 110730
Przeciwciało anty-mysie CD8a APC/Cy7 (klon: 53-6,7, partia: B247008; RRID: AB_312753)	Legenda biologiczna	100714
Foran / Izofluran	AbbVie Inc.	Zobacz materiał B506
Przefiltrowana surowica bydlęca	Pan Biotec	P40-47500	składnik buforu FACS