1. Oczyszczanie in vitro sporozoitów z oocyst C. parvum
- Oczyść sporozoity z oocyst C. parvum oocyst po wybieleniu i wypłukaniu wybielacza, jak opisano powyżej.
- Przenieś oocysty do probówki o pojemności 15 ml. Zawiesić oocysty w pożywce ekscystacyjnej o temperaturze pokojowej (0,75% w/v taurocholanu sodu w DMEM), aby uzyskać 1 x 107 oocyst / ml. Dodatek taurocholanu poprawia szybkość ekscystacji oocyst, poprawiając wydajność sporozoitów.
- Inkubować zawiesinę oocyst w temperaturze 37 °C przez 1–1,5 godziny.
- Sprawdzić próbkę pod mikroskopem pod kątem stopnia ekscytacji; 60-80% ekscystacja jest wystarczająca do dobrego odzysku sporozoitów. Jeśli poziom ekscystacji jest niski, inkubować dłużej (kolejne 30 min do 1 h).
- Określ procentową ekscystację w stosunku do liczby początkowych oocyst. Ekscystacja jest obliczana jako:
% ekscystacji = [1 – (liczba nienaruszonych oocyst/liczba oocyst na początku)] x 100
- Umyj komórki w celu usunięcia odczynników ekscystacyjnych, dodając 14 ml PBS lub pożywki, mieszając i odzyskując komórki (nienaruszone oocysty, otoczki oocyst i sporozoity) przez odwirowanie przy 3,400 x g przez 20 minut w celu odzyskania sporozoitów. Odsysaj ostrożnie, aby uniknąć utraty komórek.
- Ponownie zawiesić osad sporozoitu w 1-2 ml DMEM, aby uzyskać 3 x 107 oocyst / ml (w zależności od liczby początkowych oocyst).
- Aby usunąć pozostałe oocysty i muszle, przefiltruj zawiesinę przez filtr 3 μm (ryc. 1B). Użyć aparatu z uchwytem filtra 47 mm wyposażonego w filtr poliwęglanowy (porów o wielkości 3 μm) przymocowany do cylindra strzykawki o pojemności 10 ml. Umieść aparat z uchwytem filtra na probówce o pojemności 15 ml. Umieść zespół w pojemniku na lód lub w chłodni.
- Dodać 7,5 ml zawiesiny sporozoitu do zespołu filtra i pozostawić do przefiltrowania grawitacyjnie. Przemyć kolejnym 7,5 ml DMEM.
nuta: Aby zapewnić powodzenie izolacji sporozoitów, kluczowe znaczenie mają świeże oocysty i dobra ekscystacja. Jeśli jest zbyt wiele nieusuniętych oocyst, zawiesina nie przepłynie grawitacyjnie. Wywieranie nacisku na strzykawkę może przepchnąć nieusunięte oocysty. Mikroiniekcja sporozoitów jest trudniejsza niż oocysty, ponieważ sporozoity mogą zbrylać się i blokować naczynia włosowate. Aby tego uniknąć, zalecamy wykonanie szerszej końcówki kapilarnej podczas wstrzykiwania organoidów ze sporozoitami. Aby osiągnąć wystarczający poziom infekcji, do każdego organoidu należy wstrzyknąć 2-4 razy więcej sporozoitów w porównaniu z organoidami zakażonymi oocystami.
- Odwirować przefiltrowaną zawiesinę sporozoitu o stężeniu 3 400 x g za pomocą wahliwego wirnika kubełkowego przez 20 minut, aby osadzać sporozoity.
- Zawiesić w 50–100 μl pożywki do hodowli organoidów OME lub OMD (patrz tabela materiałów) uzupełnionej 0,05% (w/v) barwnikiem Fast Green i L-glutationem, betainą, L-cysteiną, kwasem linolowym i buforem redukującym zawierającym taurynę (patrz tabela materiałów).
nuta: Zbyt długa inkubacja oocyst może powodować lizę sporozoitów i słabą regenerację, dlatego należy tego unikać.
2. Hodowla in vitro ludzkiego jelita do mikroiniekcji
- Hodowla organoidów jelitowych w warunkach podłoży ekspandujących i różnicujących.
UWAGA: Szczegóły rozmnażania jelitowego zostały wcześniej opisane w innych artykułach (patrz Tabela materiałów dla przepisów na podłoża). W tym miejscu pokrótce opisujemy metodę hodowli organoidów ze szczególnym odniesieniem do optymalizacji pod kątem wstrzykiwania i wzrostu Cryptosporidium. Odkryliśmy, że do obrazowania pasożytów w organoidach, organoidy hodowane w pożywce ekspansywnej są lepsze niż te hodowane w pożywce różnicowej, ponieważ akumulacja zanieczyszczeń jest mniejsza niż w przypadku organoidów hodowanych w pożywce różnicującej. Jeśli jednak celem jest wyizolowanie oocyst, organoidy hodowane w pożywkach różnicujących wytwarzają znacznie większą liczbę oocyst.
- Utrzymuj organoidy w kulturach 3D w macierzy zewnątrzkomórkowej (patrz tabela materiałów) w temperaturze 37 °C. Dodaj OME (pożywkę do ekspekspansji organoidów) na wierzch i odświeżaj codziennie.
- Aby podzielić i ułożyć organoidy w płytki do mikroiniekcji, należy usunąć pożywkę z płytki 6-dołkowej zawierającej organoidy ludzkie, dodać F12+++ (patrz tabela materiałów) do dołka i rozbić matrycę, kilkakrotnie pipetując końcówką do pipety o pojemności 1 ml. Zbierz komórki do probówki o pojemności 15 ml (2 ml F12+++ na probówkę wystarcza do dalszych zabiegów).
- Dodaj 10-12 ml F12+++ do kolejnej probówki o pojemności 15 ml i umieść w pożywce pipetę z polerowanego szkła, pipetuj w górę i w dół 3 razy, aby rozbić organoidy jelitowe człowieka.
nuta: Użyj długiej szklanej pipety (20–30 cm) i krótko ją wypoleruj. Nie należy wykonywać bardzo małego otworu (o średnicy 1 mm), ponieważ organoidy mogą zostać uszkodzone. Wygładź końcówkę pipety, krótko ją polerując ogniowo. Rozbij organoidy na mniejsze kawałki o wielkości ~50 μm.
- Dodać F12+++ do 5–7 ml i odwirować przy 350 x g przez 5 min.
nuta: Prędkość wirowania na tym etapie jest wyższa niż normalnie, aby uzyskać dobry osad komórkowy, który jest dobrze oddzielony od macierzy zewnątrzkomórkowej (patrz Tabela materiałów). Zaobserwowaliśmy, że w porównaniu z mysimi organoidami jelita cienkiego, ludzkie organoidy jelita cienkiego są trudniejsze do zakłócenia.
- Usunąć jak najwięcej pożywki bez naruszania komórek, a następnie ponownie zawiesić osad z matrycą utrzymywaną w temperaturze 4 °C; wymagane jest 200–300 μl matrycy na dołek płytki sześciodołkowej. Organoidy należy podzielić jeden na trzy, aby utrzymać dość dużą gęstość komórek.
- Umieść organoidy w kropelkach matrycy o objętości około 5–10 μl każda w studzience sześciodołkowej płytki. Inkubować przez 20–30 minut w temperaturze 37 °C, a następnie dodać na wierzch pożywkę ekspandacyjną (OME).
- Zmieniaj podłoże co 2–3 dni.
nuta: Po około 5–7 dniach organoidy rosnące w EM osiągają wielkość 100–200 μm i są gotowe do wstrzyknięcia.
- Aby zróżnicować organoidy, po 5-6 dniach w EM należy zmienić pożywkę na pożywkę różnicującą (DM) i przechowywać ją przez dodatkowe 5-6 dni przed wstrzyknięciem pasożytów.
nuta: W celu ekspansji organoidów zaleca się gęste powlekanie organoidów. Do mikroiniekcji zaleca się stosowanie płytki sześciodołkowej z organoidami posianymi o mniejszej gęstości. Na przykład, organoidy płytkowe z trzech dołków z sześciodołkowej płytki do pełnej sześciodołkowej płytki do mikroiniekcji. Matrycę należy przechowywać w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania i rozmrozić w temperaturze 4 °C lub na lodzie przed użyciem.
3. Mikroiniekcja oocyst/sporozoitów do światła organoidu
- Mikrowstrzyknąć pasożyty do wierzchołkowej strony organoidu 3D (ryc. 2).
- Przygotować szklane kapilary o średnicy 1 mm za pomocą ściągacza do mikropipet.
nuta: Ustawienia używane w ściągaczu do mikropipet (patrz tabela materiałów) to: Ciepło = 663, Ciągnięcie = 100, Prędkość = 200, Czas = 40 ms. Ustawienia będą musiały zostać dostosowane zgodnie z instrukcjami użytkownika dla konkretnego urządzenia.
- Przetnij końcówkę kapilary kleszczami. Rozmiar/średnica końca kapilarnego wynosi około 9–12 μm; Umożliwia to łatwy przepływ oocyst (o wielkości 4–5 μm).
- Wypełnij kapilary zawiesiną oocysty lub sporozoitu za pomocą końcówek mikroładowacza.
- Załadować kapilarnę wypełnioną oocystą do mikrowstrzykiwacza.
- Mikrowstrzyknąć zawiesinę 100–200 nL do każdego organoidu pod odwróconym mikroskopem przy 5-krotnym powiększeniu, utrzymując stałe ciśnienie. Po mikroiniekcji należy codziennie odświeżać podłoże za pomocą OME lub OMD (pożywka do różnicowania organoidów) i utrzymywać płytkę w temperaturze 37 °C.
nuta: Do mikroiniekcji nie używamy mikromanipulatora. Zaleca się stosowanie tej samej kapilary w całym eksperymencie, aby zapewnić równe wstrzyknięcie w każdej próbce.
