$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Infekcja
- Zainfekuj komary Anopheles stephensi Plasmodium berghei ANKA, karmiąc je przez 15 minut myszą gametocytemiczną. Utrzymuj zakażone komary w temperaturze 80% wilgotności i 21 °C.
- Zbierz samice komarów z klatki od 17 do 22 dni po posiłku z krwi. Umieść je na lodzie, aby je znieczulić.
- Za pomocą kleszczy umieść trzy do czterech komarów na szklanym szkiełku pokrytym kroplą zimnego podłoża RPMI. Umieść szkiełko pod mikroskopem.
- Za pomocą kleszczy ostrożnie rozciągnij komara między głową a ciałem. Odizolować gruczoł ślinowy za pomocą strzykawki i igły. Powtórz tę procedurę z pozostałymi komarami.
- Pobrać gruczoły ślinowe ze szkiełka podstawowego, zasysając je szklaną pipetą i zbierając do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
nuta: W zależności od wskaźników infekcji, zwykle można uzyskać od 8 000 do 15 000 zakaźnych sporozoitów na gruczoł ślinowy.
- Przez około 3 minuty rozbij izolowane gruczoły ślinowe w probówce wirówkowej małym, plastikowym patyczkiem, aby wyizolować sporozoity z tkanki gruczołu ślinowego.
- Wirować przez 3 minuty w temperaturze 1 000 x g i w temperaturze 4 °C w celu oczyszczenia sporozoitów z pozostałej tkanki.
- Odpipetować supernatant, który zawiera sporozoity (SPZ), do nowej probówki wirówkowej i odliczyć oczyszczone sporozoity w hemocytometrze Neubauera.
- Dostosuj stężenie oczyszczonych sporozoitów do 10 000/ml, dodając sól fizjologiczną buforowaną fosforanami.
- Wstrzyknij łącznie 1,000 sporozoitów (0,1 ml) do żył ogonowych wsobnych myszy C57BL/6, aby zainicjować infekcję. Aby ułatwić wstrzykiwanie, umieść myszy C57BL/6 w unieruchomieniu i umieść ogony w ciepłej (około 37 °C) wodzie, aby pomóc w wizualizacji żył ogonowych.
nuta: Sam zastrzyk jest krótkim zabiegiem, który można wykonać w ciągu kilku sekund.
- Raz dziennie sprawdzaj parazytemię w fazie krwi w rozmazach krwi od 3 dnia po zakażeniu SPZ.
- Oceniaj myszy raz dziennie za pomocą skali szybkiej mysiej śpiączki i zachowania (RMCBS), zaczynając od 5 dnia po wstrzyknięciu sporozoitu.
- Oceń myszy za pomocą obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI) zgodnie z wynikiem Szybkiej Skali Śpiączki i Zachowania Myszy (RMCBS) oraz pytaniem badawczym, na które należy odpowiedzieć.