Wizualizacja pułapek zewnątrzkomórkowych w makrofagach z ludzkich płynów płucnych oskrzelowo-pęcherzykowych

Abstract

Źródło: Sharma, R. et al., Wizualizacja pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów za pomocą mikroskopii konfokalnej. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film demonstruje znakowanie immunologiczne pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów, MET, w makrofagach oskrzelowo-pęcherzykowych z płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, oraz ich wizualizację za pomocą mikroskopu konfokalnego.

Protocol

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Makrofagi z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL)

1. Użyj BAL, aby uzyskać makrofagi płucne u (1) ludzi za pomocą bronchoskopii i (2) myszy za pomocą aspiracji dotchawiczej.
   nuta: Przejęcie makrofagów na ogół powoduje pewną aktywację tych komórek. Makrofagi uzyskuje się od pacjentów, którzy wymagają bronchoskopii w celu zbadania potencjalnego problemu medycznego i nie wszyscy uczestnicy mogą nadawać się do analizy pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów lub MET (będzie to musiało zostać określone dla każdego indywidualnego projektu).
   1. Weź roztwór BAL i odwiruj go (500 x g przez 10 min), aby powstał osad, przemyć dwukrotnie pożywką hodowlaną (Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) z 5% płodową surowicą cielęcą i 1% L-glutaminą) w temperaturze pokojowej, a następnie rozcieńczyć komórki w 4 ml pożywki hodowlanej.
   2. Jeśli to konieczne, poproś o formalne zliczenie różnicowe; większość komórek (zwykle >80%) będzie makrofagami.
      nuta: Zazwyczaj będzie to wykonywane przez kliniczną usługę histologiczną z wykorzystaniem morfologicznego wyglądu różnych typów komórek.
   3. Przeprowadzić żywotną liczbę komórek makrofagów w roztworze BAL, używając wykluczenia błękitu trypanowego i hemocytometru.
      nuta: Roztwór BAL uzyskuje się od ludzi i myszy, jak wspomniano w kroku 1.1.
   4. Dodać 1 - 4 x 10⁵ makrofagów do 24-dołkowych płytek na szkiełkach nakrywkowych w 500 μl pożywki hodowlanej na basenie i pozostawić na noc w temperaturze 37°C; komórki przylgną do szkiełek nakrywkowych. W przypadku próbek pobranych od ludzi należy dodać antybiotyki (np. penicylinę i streptomycynę, 10⁴ U/ml), aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu.

2. Znakowanie immunofluorescencyjne/mikroskopia makrofagów BAL

UWAGA: Komórki są przyklejone do szkiełek nakrywkowych, jak wspomniano powyżej.

1. Usunąć pożywkę hodowlaną i raz przemyć komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Utrwalić komórki w 2% utrwalaczu paraformaldehydu/periodatu/lizyny (PLP) przez 10 min.
2. Umyj komórki krótko w PBS, a następnie przepuszczalność w 0,2% Tween 20 w PBS przez 20 minut.
3. Blokuj komórki z 10% surowicą kurczaka w 5% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) rozcieńczonej w PBS przez 30 min.
4. Inkubować z pierwszorzędowymi i kontrolnymi przeciwciałami izotypowymi przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w stężeniach 1:100 (bardziej szczegółowe informacje podano w tabeli materiałów) w temperaturze 37 °C.
   nuta: W przypadku próbek BAL zwykle nie jest wymagany specyficzny marker makrofagów.
5. Po dodaniu przeciwciał pierwszorzędowych umyć komórki w PBS i dalej inkubować z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi przez 40 minut w temperaturze pokojowej.
6. Umyj sekcje w PBS i zamontuj za pomocą medium montażowego na bazie DAPI w celu wizualizacji za pomocą mikroskopu konfokalnego (jak wspomniano powyżej) przy wzbudzeniach laserowych 405, 488, 561 i 647 nm oraz obiektywie olejowym 40X, 1.0 NA.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Próbki ludzkie: Przeciwciała pierwszorzędowe
Królik anty-ludzki H3Cit (Cytrulina R26)	Księga Abcam	Zobacz materiał AB5103	10 μg/ml
Mysz anty-ludzka MMP9	Novus Biologiczny	AB119906	1:200 wodobrzusze, bez podanego stężenia
Królik anty-ludzki PADI2/PAD2	Księga Abcam	AB16478	7 μg/ml
Mysz anty-ludzka PADI4/PAD4	Księga Abcam	AB128086	10,1 μg/ml
Przeciwciała drugorzędowe
Kurczak anty-królik AF 488/	Technologie życiowe	A-21441
Kurczak anty-królik AF 594	Technologie życiowe	A-21442
Kurczak anty-kozioł AF 594	Technologie życiowe	A-21468
Kurczak anty-myszy AF488	Technologie życiowe	A-21200
Programy komputerowe
Imaris	Płaszczyzna bitowa
Obraz J	Nih
Do uśrednienia intensywności fluorforów można użyć standardowej aplikacji biurowej, takiej jak Microsoft Excel
Mikroskopy
C1 Konfokalny mikroskop skaningowy	Nikon
FV1200 Konfokalny mikroskop skaningowy	Olympus
Próbki ludzkiego BAL z pracowni bronchoskopii w Monash Medical Center
media
Prędkość obrotowa	Sigma-Aldrich	Przekaźnik Przemysłowy R8758
Surowica cielęca płodu	Sigma-Aldrich	F0926
L-glutamina	Sigma-Aldrich	Klasa G7513
Inne odczynniki
utrwalacz paraformaldehydu/periodatu/lizyny (PLP)	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 27387
Naturalna formalina	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 42904
Szkiełka nakrywkowe 12 ml	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S1815
Szkiełka nakrywkowe 60 x 24 ml	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C6875