1. Kultura grzybów dla M.grisea
- Przygotuj pożywkę do hodowli pomidorów owsianych (OTA) dla szczepów grzybów.
- Zważ 30 - 50 g płatków owsianych, dodaj je do 800 ml wody destylowanej/dejonizowanej (ddH2O) i gotuj mieszaninę przez 30 minut w garnku elektrycznym.
- Przefiltruj ugotowany sok owsiany do zlewki przez kawałek gazy.
- Dodać 150 ml soku pomidorowego i 20 g agaru do filtratu w zlewce i dodać ddH2O do 1 000 ml.
2. Przygotowanie materiałów doświadczalnych
- Namocz około 50 nasion ryżu (Oryza sativa) odmiany Lijiangxintuan-heigu (LTH) w ddH2O przez 3 dni lub namocz około 50 nasion jęczmienia (Hordeum vulgare cv Golden Promise) w ddH2O przez około 1 d.
- Zawinąć nasiona ryżu lub jęczmienia w wilgotną gazę i wykiełkować je na wilgotnej bibule filtracyjnej na około 30 szalkach Petriego o średnicy 10 cm x 10 cm w temperaturze 28 °C. Czas kiełkowania nasion ryżu wynosi około 2 - 3 dni, a czas kiełkowania nasion jęczmienia wynosi około 2 dni. Wilgotność względna w szklarni wynosi około 70%.
- Posadź sadzonki ryżu lub jęczmienia w doniczkach, używając autoklawowanej ziemi doniczkowej i podlewania, a następnie przykryj je warstwą wermikulitu.
- Umieść rośliny w odpowiedniej szklarni lub komorze wzrostowej w temperaturze 25 °C na około 1 ~ 2 tygodnie.
- Wytnij 3 warstwy bibuły filtracyjnej w kółkach sterylnymi nożyczkami chirurgicznymi (każde kółko powinno mieć średnicę 8 cm) i umieść je na sterylnych plastikowych płytkach o średnicy 100 mm.
- Dodaj ddH2O do każdego naczynia, aby namoczyć bibułę filtracyjną.
- Upewnij się, że bibuła filtracyjna jest całkowicie mokra, ale nie dodawaj dodatkowej wody.
- Usuń nadmiar wody za pomocą pompy próżniowej.
- Umieść 2 sterylne wykałaczki w naczyniu hodowlanym, aby podeprzeć liście ryżu/jęczmienia; rozmieść wykałaczki w odległości ~2 - 3 cm od siebie.
- Zbierz liście ryżu 2 tygodnie po wysianiu nasion lub weź liście jęczmienia 7 dni po wysianiu nasion.
- Używając 4- do 6-listnych sadzonek ryżu/jęczmienia, odetnij dolną część łodygi w odległości ~5 cm od góry i zbierz liście.
3. Ranienie Inokulacja kostkami grzybni lub kropelkami konidialnej zawiesiny M. grisea
- Za pomocą anatomicznej igły zeskrob trzy rany o długości 2-3 cm w głównych żyłach oderwanych liści ryżu/jęczmienia; uważając, aby nie przebić liści.
- Połóż zeskrobane liście na wykałaczkach i spryskaj liście 0,02% (v/v) roztworem Tween-20 na liście, aby utworzyć warstwę kropelek.
- Wytnij korek grzybni o wymiarach 0,5 cm x 0,5 cm dla każdego szczepu M. grisea (szczepy typu dzikiego, zmutowanego, dopełniacza lub innych szczepów testowych) z płytki OTA.
- Umieścić korki grzybniowe lub 25 μl kropelek zawiesiny konidialnej na zranionych liściach i inkubować liście w temperaturze 25 °C w wilgotnej komorze przez 3 - 8 dni.
- Zbadaj zmiany w 5 - 7 dniu po inokulacji. Metoda badania jest taka sama, jak w przypadku metody inokulacji w aerozolu (patrz krok 1.3.13).
- Zbadaj chore źdźbła ryżu/jęczmienia o długości ~6 cm i sfotografuj je, aby ocenić infekcję badanych szczepów. Zakażenie oceniano na podstawie liczby zmian na 3,6cm2.
