1. Produkcja rekombinowanego HBV kodującego białko reporterowe
- Przygotowanie komórek HepG2
- Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych (zmodyfikowaną pożywkę Eagle's Dulbecco lub DMEM) uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 100 U/ml aminokwasów endogennych).
- Płytka 4 x 106 komórek HepG2 w 10-centymetrowym naczyniu pokrytym kolagenem w 10 ml pożywki hodowlanej dzień przed transfekcją. Inkubować komórki HepG2 w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5%CO2.
nuta: Gdy około 4 x 106 komórek HepG2 zostanie posianych w 10 cm naczyniu pokrytym kolagenem w 10 ml pożywki hodowlanej, następnego dnia będą one w 70-90% zlewane.
- Transfekcja
- Transfekcję komórek HepG2 za pomocą 5 μg pUC1.2HBV (wirus zapalenia wątroby typu B) delta epsilon i 5 μg pUC1.2HBV/NL15 przy użyciu odczynnika do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta.
- Następnego dnia usuń pożywkę hodowlaną i dodaj 10 ml świeżej pożywki hodowlanej.
- Tydzień po transfekcji przenieść pożywkę hodowlaną zawierającą rekombinowany wirus HBV do probówki o pojemności 50 ml i przejść do etapu 1.3.1. Dodać 10 ml świeżej pożywki hodowlanej do płytki zawierającej transfekowane komórki.
nuta: Produkcja rekombinowanego wirusa HBV utrzymuje się przez 4 tygodnie. Pożywka zawierająca rekombinowany wirus HBV może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.
- Oczyszczanie rekombinowanego wirusa HBV
- Usunąć resztki komórek z pożywki zawierającej rekombinowany wirus HBV przez odwirowanie (2 300 x g przez 5 minut).
- Przepuścić supernatant przez filtr membranowy 0,45 μm.
- Dodać równą objętość 26% PEG/1,5 M NaCl (glikol polietylenowy 6000: 130 g, NaCl, 49 g, 1 ml 0,5 M EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy) o pH 8,0 i 5 ml 1 M HEPES (4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego) (pH 7,6 w 500 ml) do pożywki zawierającej rekombinowany HBV i delikatnie wymieszać. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
- Wirować przy 2 300 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
- Odrzucić supernatant i rozpuścić osad w 0,5 ml TNE (10 mM Tris (tris(hydroksymetylo)aminometan), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
- Usunąć zanieczyszczenia przez odwirowanie w stężeniu 2.300 x g przez 5 minut.
- Załadować 0,5 ml TNE zawierającego rekombinowany HBV na 0,8 ml 20% sacharozy w TNE.
- Wirować przy 100 000 × g przez 3 godziny w temperaturze 15 °C.
- Wyrzuć jak najwięcej supernatantu i zachowaj osad. Zawiesić go ponownie w 1 ml DMEM bez surowicy na 40 ml wyjściowej pożywki hodowlanej.
- Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
- Przefiltruj przez filtr 0,45 μm. Przygotować 0,5 ml porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C.
nuta: W przypadku zaobserwowania zanieczyszczenia białkom reporterowym oryginalnej próbki wirusa, należy oczyścić wirusa przez ultrawirowanie w gradiencie gęstości 5-30% sacharozy w TNE przy 100 000 x g przez 2 godziny lub wirowanie w równowadze gęstości CsCl od 1,1-1,6 g/ml przy 150 000 x g przez 50 godzin.
2. Zakażenie rekombinowanym wirusem HBV
- Hodowla komórek HepG2 stabilnie eksprymujących NTCP (polipeptyd kotransportujący taurocholan sodu) (HepG2/NTCP), które są podatne na zakażenie HBV w DMEM uzupełnionym 10% FBS, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 250 μg/ml G-418 (genetycyna) i 100 U/ml aminokwasów endogennych w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze 5% CO2 .
- Na dzień przed zakażeniem umieść około 5 x 104 komórek HepG2/NTCP na 96-dołkowej płytce pokrytej kolagenem w 0,1 ml pożywki hodowlanej.
- Rozmrażać rekombinowany wirus HBV w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż w fiolce pozostanie niewielka ilość lodu.
- Przygotuj pożywkę do infekcji, łącząc następujące elementy: 10 μl 40% PEG8000 w 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 2 μl dimetylosulfotlenku (DMSO), 10 μl rekombinowanego HBV i 78 μl świeżej pożywki hodowlanej na basenik 96-dołkowej płytki.
- Dodać 100 μl rekombinowanego roztworu HBV do jednego dołka z 96-dołkowej płytki.
- Jednego dnia po zakażeniu przemyj zakażone komórki 3 razy 300 μl PBS na studzienkę, aby usunąć zanieczyszczające białko reporterowe z frakcji wirusa.
- Inkubować zakażone komórki w 200 μl pożywki hodowlanej zawierającej 2% DMSO przez jeden tydzień lub krócej.
3. Analiza
- Tydzień po zakażeniu przemyj zainfekowane komórki 3 razy PBS.
- Dodać 50 μl buforu do lizy do zakażonych komórek.
- Kołysz płytkę hodowlaną przez 5 minut, a następnie odwiruj przy 2 000 x g przez 5 minut.
- Dodać 50 μl substratu reporterowego do płytki luminometru.
- Dodać 20 μl lizatu komórkowego do płytki luminometru zawierającej substrat reporterowy. Wymieszaj, krótko wirując.
- Umieść płytkę w luminometrze i rozpocznij odczyt.
