Transplantacja prekursorów neuronalnych jest obiecującą strategią ochrony i/lub zastępowania utraconych lub dysfunkcyjnych szyjnych neuronów ruchowych nerwu przeponowego w przypadku urazów rdzenia kręgowego (SCI) oraz w przebiegu stwardnienia bocznego zanikowego (ALS), będącego chorobą neuronów ruchowych. Przedstawiamy protokół dostarczania komórek do przedniego rogu szyjnego rdzenia kręgowego w gryzoniach w modelach ALS i SCI.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wewnątrzrdzeniowa transplantacja komórek w celu ukierunkowania na przednie rogi rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym w stwardnieniu bocznym zanikowym i urazowym uszkodzeniu rdzenia kręgowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Niewydolność oddechowa spowodowana utratą ruchowych neuronów nerwu przeponowego jest wyniszczającym następstwem znacznej części przypadków urazowych uszkodzeń rdzenia kręgowego (SCI) u ludzi 1 oraz bezpośrednią przyczyną śmierci u pacjentów z chorobą neuronów ruchowych, bocianym stwardnieniem amerykańskim (ALS) 2.
ALS to wyniszczające schorzenie neurologiczne, które charakteryzuje się stosunkowo szybką degeneracją górnych i dolnych neuronów ruchowych. Pacjenci ostatecznie zapadają na chorobę średnio od 2 do 5 lat po diagnozie z powodu paraliżu oddechowego wynikającego z utraty unerwienia przepony przez neurony ruchowe nerwu przeponowego 3. Zdecydowana większość przypadków ma charakter sporadyczny, natomiast 10% to postać rodzinna. Około dwudziestu procent przypadków rodzinnych jest powiązanych z różnymi mutacjami punktowymi w genie dysmutazy ponadtlenkowej 1 (SOD1) zawierającej miedź i cynk (Cu/Zn) na chromosomie 21 4. Stworzono transgeniczne myszy 4,5 i szczury 6 niosące zmutowane ludzkie geny SOD1 (G93A, G37R, G86R, G85R), które mimo istnienia innych modeli zwierzęcych utraty neuronów ruchowych, są obecnie najczęściej wykorzystywanymi modelami tej choroby.
Uraz rdzenia kręgowego (SCI) to heterogeniczna grupa stanów wynikających z fizycznego urazenia rdzenia kręgowego, przy czym efekty funkcjonalne różnią się w zależności od rodzaju, lokalizacji i stopnia ciężkości urazu 7. Niemniej jednak, około połowy przypadków SCI u ludzi dotyczy odcinków szyjnych, co prowadzi do wyniszczającej dysfunkcji oddechowej z powodu utraty motoneuronów przeponowych oraz uszkodzenia zstępujących aksonów oddechowych opuszkowo-rdzeniowych 1. Opracowano szereg zwierzęcych modeli SCI, z których najczęściej stosowanym i najbardziej istotnym klinicznie jest model kontuzyjny 8.
Transplantacja różnych klas komórek prekursorowych neuronów (NPCs) stanowi obiecującą strategię terapeutyczną w leczeniu urazowych uszkodzeń OUN oraz neurodegeneracji, w tym ALS i SCI, ze względu na zdolność do zastępowania utraconych lub dysfunkcyjnych typów komórek OUN, zapewniania neuroprotekcji oraz dostarczania wybranych czynników genowych 9.
Modele zwierzęce zarówno ALS, jak i SCI mogą odwzorowywać wiele istotnych klinicznie aspektów tych schorzeń, w tym utratę neuronów ruchowych nerwu przeponowego i wynikające z tego zaburzenia oddechowe 10,11. Aby ocenić skuteczność strategii opartych na NPC w zakresie funkcji oddechowych w tych zwierzęcych modelach ALS i SCI, interwencje komórkowe muszą być skierowane konkretnie do obszarów zawierających cele terapeutyczne, takich jak neurony ruchowe nerwu przeponowego. Przedstawiamy szczegółowy protokół wielosegmentowego, wewnątrzrdzeniowego przeszczepiania NPC do przedniej szarej substancji szyjnego rdzenia kręgowego w modelach neurodegeneracyjnych, takich jak myszy i szczury SOD1G93A, a także w przypadku szczurów i myszy z uszkodzeniem rdzenia kręgowego 11.
Protokół
Metody
1. Przygotowanie komórek
Jako przykład opiszemy procedurę przygotowania komórek progenitorowych gleju 12 do transplantacji, bazując na naszym doświadczeniu z tym typem komórek. Należy jednak pamiętać, że szczegóły protokołu, w tym rodzaj pożywki czy zastosowanie trypsyny, będą zależeć od konkretnego typu komórek wykorzystywanych w transplantacji.
- Podgrzej wstępnie wszystkie roztwory do 37.0°C w kąpieli wodnej.
- Przepłucz kolbę 2 razy roztworem HBSS. Dodaj 5.0 mL/kolba T-75 0.05% Trypsyny/EDTA. Inkubuj kolbę przez 3 minuty w inkubatorze w temperaturze 37.0°C. Przenieś zawiesinę delikatnie 3 razy w kolbie za pomocą pipety 5 lub 10 mL.
Opcjonalnie: Dodaj 5,0 mL/kolbę T-75 inhibitora trypsyny z soi w stężeniu 1,0 mg/ml w DMEM/F12.
- Każdą kolbę przepłucz 2 razy w 5,0 mL pożywki. Połącz komórki z płynami z płukania. W kolejnych krokach utrzymuj komórki w lodzie.
- Wirować przy 200-300 g przez 5 minut w probówce stożkowej: najlepiej w wirówce chłodzonej do 4°C. Odlać (i zachować) nadsącz. Ponownie zawiesić komórki w 1,0 mL pożywki i przenieść do probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 mL.
- Policzyć komórki za pomocą hemocytometru, stosując błękit trypanu w celu określenia żywotności.
- Ponownie wirować w probówce 1,5 mL (800 RPM przez 10 minut: najlepiej w wirówce chłodzonej do 4°C). Odlać (i zachować) nadsącz.
- Ponownie zawiesić komórki w pożądanej końcowej objętości pożywki, aby uzyskać odpowiednie zagęszczenie komórek.
- Rozdzielić zawiesiny komórkowe do kilku probówek Eppendorfa o pojemności 1,5 mL. Przechowywać komórki w lodzie kruszonym do momentu transplantacji.
Nie należy używać probówek o pojemności 0,75 mL, ponieważ strzykawka/igła Hamiltona nie może zostać wprowadzona głęboko do takiej probówki. Podczas sesji chirurgicznych prawdopodobnie zostanie wykonanych wiele wstrzyknięć, dlatego należy unikać wielokrotnego niepokojenia komórek w tej samej probówce. Należy starać się przygotować co najmniej 50% większą objętość zawiesiny komórkowej niż jest to wymagane. Przez cały czas trwania zabiegu komórki należy przechowywać w lodzie. Przeszczepienie komórek powinno nastąpić w ciągu 4–5 godzin od przygotowania zawiesin, aby zapewnić najwyższą żywotność komórek po transplantacji.
2. Przygotowanie przed operacją
- Przed operacją należy przeprowadzić odpowiednie oceny behawioralne linii bazowej.
- Immunosupresja: podawanie cyklosporyny A (CSA: 10,0 mg/kg masy ciała) podskórnie lub FK-506/Rapamycyny (1,0 mg/kg masy ciała) dootrzewnowo (I.P.) powinno rozpocząć się co najmniej 3 dni przed transplantacją i być kontynuowane codziennie aż do uśmiercenia zwierząt. Nie zaleca się podawania leków w wodzie pitnej (zamiast codziennych iniekcji). CSA jest preferowanym przez nas lekiem immunosupresyjnym przy transplantacji komórek pochodzenia gryzoni, natomiast FK-506/Rapamycyna jest wybierana przy transplantacji komórek pochodzenia ludzkiego.
- Narzędzia chirurgiczne należy wysterylizować w autoklawie przed operacją. Należy przygotować uporządkowane i czyste miejsce do przeprowadzenia zabiegu, a także wolną przestrzeń na odłożenie narzędzi. Przydatny jest również sterylizator koralikowy. Wszystkie narzędzia (zwłaszcza kleszczyki kostne) muszą pozostać czyste podczas operacji, co znacznie ułatwi procedurę. Wszelkie materiały wykorzystywane podczas zabiegu chirurgicznego muszą być sterylne.
- Instrumenty, których nie można wysterylizować, takie jak mikroskop chirurgiczny, należy przetrzeć odpowiednim środkiem dezynfekcyjnym, a ich uchwyty pokryć sterylnym materiałem (np. gazą), aby chirurg po założeniu sterylnych rękawiczek nie doprowadził do ich zanieczyszczenia.
- Przed rozpoczęciem operacji chirurg powinien umyć ręce środkiem dezynfekcyjnym (preparatem z chlorheksydyną). Chirurg powinien nosić sterylne rękawiczki, maseczkę ochronną oraz czysty fartuch.
3. Chirurgia: przygotowanie zwierząt i zabieg chirurgiczny
Przygotowanie zwierząt:
- Zważyć zwierzę i podać odpowiednią dawkę znieczulenia: izofluran drogą wziewną lub koktajl anestetyczny (podawany d.o.t.cznie) składający się z [maleinianu acepromazyny (0.7 mg/kg), ketaminy (95 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg)].
- Ucisnąć palec stopy i/lub wykorzystać odruch powiekowy (dotknięcie górnej powieki aplikatorem z watą w celu obserwacji mrugania), aby określić, czy zwierzę jest prawidłowo znieczulone. Przed operacją należy zabezpieczyć rogówki, nakładając maść z sztucznymi łzami.
- Wygolić sierść na grzbiecie maszynką elektryczną (bez potrzeby stosowania nasadek). Golić od miejsca nieco rostralnie względem uszu do środka grzbietu zwierzęcia. Golić dokładnie i usunąć ściętą sierść ze skóry, aby zapobiec dostaniu się włosów do nacięcia. Przygotowanie chirurgiczne powinno być przeprowadzone z dala od miejsca, w którym będzie wykonywana operacja, aby uniknąć zanieczyszczenia pola operacyjnego luźnymi włosami.
- Nasączyć gazę antyseptycznym roztworem Povidine-Iodine i nałożyć na skórę w wygolonym obszarze. Pole operacyjne należy przemyć co najmniej dwukrotnie roztworem Povidine-Iodine, pamiętając o szorowaniu od centrum pola ku obwodowi. Następnie miejsce to można opłukać 70% alkoholem lub rozcieńczonym środkiem bakteriobójczym. Obszar należy przykryć jałowymi chustami.
- W trakcie operacji wysoce zaleca się stosowanie mata grzewczego w celu utrzymania prawidłowej temperatury ciała zwierzęcia. Ponadto należy monitorować temperaturę ciała. Umieścić zwierzę na zwiniętym gaziku. W przypadku dorosłego szczura zwinięty gazik powinien mieć grubość ˜1.0 inch i długość ˜6.0 inches. Przymocować gazik taśmą do stołu operacyjnego, aby się nie przesuwał. Umieścić zwierzę na gaziku na wysokości klatki piersiowej/barków. Rozprostować obie przednie kończyny na gaziku i przymocować je taśmą do stołu operacyjnego. Celem jest uniesienie rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym, aby ułatwić pracę podczas całej operacji, ponieważ rdzeń szyjny znajduje się głęboko pod powierzchnią skóry.
Operacja:
- Przy najniższym powiększeniu mikroskopu (używamy powiększenia 8x), za pomocą ostrza skalpela wykonaj nacięcie w linii środkowej. Drugą ręką rozciągnij skórę bocznie, aby była napięta (co ułatwia nacinanie), i wykonaj nacięcie od podstawy czaszki do łopatki (patrz Rysunek 1).
- Za pomocą ostrza skalpela wykonaj nacięcie przez 3 warstwy mięśni nad kolumną kręgosłupa. Drugą ręką lekko uciśnij mięśnie (od strony bocznej do przyśrodkowej) po obu stronach. Należy naciskać skalpelem wystarczająco mocno, aby przeciąć wszystkie warstwy mięśni przy jak najmniejszej liczbie cięć, tak aby brzegi nacięć nie były poszarpane, co ułatwi późniejsze szycie po zakończeniu operacji. Jednak nie należy naciskać zbyt mocno, aby uniknąć uszkodzenia głębszych tkanek (kolumny kręgosłupa).
- Za pomocą dwóch aplikatorów z końcówką bawełnianą, wykonując ruchy obrotowe, oddziel mięśnie powierzchowne od mięśni przykręgosłupowych. Na tym etapie można działać energicznie. Nie należy ciąć ani rozdzierać tkanek, ponieważ spowoduje to krwawienie. Ruchy obrotowe aplikatorami pozwolą na sprawne rozdzielenie tkanek bez powodowania uszkodzeń lub krwotoku. Jeśli na jakimkolwiek etapie operacji wystąpi krwawienie, najlepiej zachować cierpliwość. Nie należy spieszyć się przy dużym krwawieniu, ponieważ krew zasłoni pole operacyjne. W miejscu krwawienia można zastosować kauteryzację lub lekki ucisk, jednak uważamy, że cierpliwość jest najlepszym rozwiązaniem. Przy wprawie krwawienie podczas tej operacji powinno być minimalne lub nie występować wcale.
- Odciągnij mięśnie za pomocą 4 własnoręcznie wykonanych haków (patrz Rysunek 2). Haki te można wykonać z mocnych spinaczy do papieru uformowanych w kształt retraktora (patrz Rysunek 2-wstawka). Przed operacją należy je wysterylizować w autoklawie. Należy zadbać o to, aby końcówki haków były stępione, aby uniknąć uszkodzenia tkanek. Do haków przywiąż sznurek. Pole operacyjne powinno mieć kształt kwadratu lub prostokąta. Kształt ten można uzyskać, odciągając tkanki w cztery rogi za pomocą 4 haków. Sznurki przymocuj taśmą do planszy, aby unieruchomić haki (patrz Rysunek 2). Można również użyć dostępnych komercyjnie retraktorów, ale wolimy z nich rezygnować. Kluczowe jest stworzenie dobrego pola operacyjnego, aby mieć wyraczną widoczność przez cały czas trwania zabiegu. Nie należy kontynuować pracy „na ślepo”.
- Oczyść powierzchnię grzbietową kolumny kręgosłupa z mięśni przykręgosłupowych. W celu usunięcia mięśni przykręgosłupowych z grzbietowej powierzchni kolumny kręgosłupa można zastosować dwie strategie. W pierwszej strategii użyj pęsety z ząbkami i średniej wielkości nożyczek sprężynowych, aby usunąć mięśnie przykręgosłupowe z grzbietowej powierzchni kręgów. Staraj się wykonywać cięcia bardzo blisko kości, aby lepiej odsłonić jej powierzchnię. Wykonuj cięcia równolegle do powierzchni kręgów, ale nie nacinaj rdzenia. W drugim podejściu wykonaj nacięcie w linii środkowej w mięśniach przykręgosłupowych i odciągnij je bocznie mniejszymi hakami. W tym drugim podejściu mięśnie można po operacji zszyć.
- Dokładnie oczyść powierzchnię kości kręgowej. Użyj kleszczy kostnych rongeur (najważniejszy instrument chirurgiczny), aby usunąć mięśnie na poziomach C4, C5 i C6 (patrz Rysunek 3). Zależy to oczywiście od docelowych poziomów kręgosłupa. Podczas używania kleszczy rongeur jedną ręką, drugą ręką unieruchom całą kolumnę kręgosłupa, chwytając pęsetą z ząbkami mięsień nad wyrostkiem C2. C2 to duży wyrostek rostralny w polu operacyjnym. C3 znajduje się również lekko pod mięśniem. Poziomy C4, C5 i C6 są łatwo dostępne, ponieważ pokrywa je niewiele mięśni.
- Zacznij od laminektomii na poziomie C5. Ponownie unieruchom kręg C2 pęsetą z ząbkami. Chwyć cały łuk kręgowy (patrz schemat: chwyć w pobliżu linii środkowej) kleszczami rongeur. Ustaw kleszcze rongeur tak, aby narzędzie było całkowicie prostopadłe do osi kolumny kręgosłupa. Powoli zmiażdż łuk kręgowy. Nie naciskaj w stronę rdzenia kręgowego, ponieważ spowoduje to uszkodzenie tkanki rdzeniowej. Zmiażdż i ostrożnie pociągnij złamany fragment kości do góry. Kleszcze rongeur powinny zmiażdżyć fragment w taki sposób, aby można go było łatwo usunąć. Jeśli fragment kości jest nadal przytwierdzony do reszty łuku, nie szarp go, ponieważ spowoduje to krwawienie i możliwy uraz rdzenia kręgowego. Kleszcze rongeur powinny być czyste i ostre. Instrumenty takie jak kleszcze rongeur należy przemywać/wycierać sterylną solą fizjologiczną, którą można przygotować w sterylnym naczyniu (patrz Rysunek 4).
Przy początkowym otwarciu laminektomii preferowane jest ustawienie kleszczy rongeur prostopadle do kolumny kręgosłupa. Następnie można przejść do pobierania małych „kęsów” w celu rozszerzenia laminektomii, wsuwając kleszcze rongeur delikatnie pod kość pod kątem około 30-60 stopni względem powierzchni rdzenia. - Rozszerz laminektomię na wszystkie łuki kręgowe C4-C6. Wykonaj jedno ciągłe otwarcie w kości na trzech poziomach kręgosłupa. Zakres laminektomii można dostosować w zależności od pożądanej lokalizacji wstrzyknięcia do przestrzeni wewnątrzrdzeniowej.
- Nie rozszerzaj laminektomii zbyt daleko bocznie, ponieważ spowoduje to krwawienie. Aby trafić w róg przedni, miejsce wstrzyknięcia znajduje się stosunkowo przyśrodkowo, więc nie ma potrzeby rozszerzania laminektomii daleko bocznie (patrz Rysunek 5).
- Zwiększ powiększenie do ok. 15x.
- Usuń tkankę łączną (i ewentualną zaschniętą krew) z wierzchu opony twardej za pomocą ostrych/prostych pęset nr 5. Rozróżnienie między tkanką łączną a oponą twardą wymaga doświadczenia.
- Nacinaj oponę twardą (bardzo wytrzymałą warstwę oponową) za pomocą mini-nożyczek sprężynowych lub mikro-noża. Wykonaj nacięcie równolegle do osi kolumny kręgosłupa, tuż przyśrodkowo od strefy wejścia tylnych korzonków. Pozwoli to na dotarcie do rogu przedniego (patrz Rysunek 6).
- Użyj ostrych/prostych pęset nr 5, aby chwycić i lekko unieść oponę twardą znad rdzenia kręgowego. Nie przyciśnij ani nie uszkodź rdzenia kręgowego. Wymaga to wprawy. Wykonuj nacięcia mikro-nożem lub bardzo małymi nożyczkami sprężynowymi. Nie uszkadzaj rdzenia kręgowego.
- Rozszerz nacięcie nieco w osi rostralno-kaudalnej. Napięcie opony twardej spowoduje jej lekkie rozdzielenie, tworząc dobrą ekspozycję rdzenia kręgowego.
- Wykonaj nacięcia we wszystkich odpowiednich miejscach dla każdego planowanego wstrzyknięcia. Opona twarda ma mętny, półprzezroczysty wygląd, podczas gdy powierzchnia rdzenia kręgowego jest jaśniejsza i biała. Należy nauczyć się je rozróżniać. Zaleca się, aby nie próbować wstrzykiwać przez oponę twardą za pomocą igły. Opona twarda jest twarda, więc trudno ją przebić. Ponadto przebicie opony twardej może wpłynąć na trajektorię wprowadzania igły, a tym samym na anatomicznie celowane dostarczenie komórek.
- Wstrzyknij komórki obustronnie na 3 poziomach (łącznie 6 miejsc), aby objąć duży region zgrubienia szyjnego. Liczba i lokalizacje wstrzyknięć zależą oczywiście od konkretnego eksperymentu.
- Po przebiciu opony twardej wypłynie płyn mózgowo-rdzeniowy. Osusz powierzchnię rdzenia i całe pole operacyjne gazikiem lub aplikatorem z końcówką bawełnianą.
- Do wstrzykiwania komórek użyj szczelnej strzykawki Hamiltona RN o pojemności 10,0 µL.
- Załóż metalową igłę Hamiltona RN 33G z zakończeniem ściętym pod kątem 45 stopni. Igła powinna być ostra. Używaj tej samej igły tylko do ok. 20 wstrzyknięć (igła pozostaje ostrzejsza przy mniejszej liczbie użyć). Można również użyć wyciąganych szklanych kapilar jako igieł. Użyj żywicy epoksydowej, aby przymocować szklaną końcówkę do tępej metalowej igły Hamiltona 26G. Przytnij średnicę zewnętrzną końcówki do ok. 75,0-100,0 µm (w zależności od średnicy komórek: nie chcemy uszkodzić komórek podczas wstrzykiwania), korzystając z mikroskopu chirurgicznego i szkiełka mikrometrycznego. Preferujemy metalowe igły 33G.
- Komórki w probówce Eppendorf na lodzie łatwo osiadają. Bezpośrednio przed nabraniem zawiesiny do strzykawki, delikatnie stukaj w probówkę, aż komórki powrócą do zawiesiny. Nie potrząsaj zbyt intensywnie, ponieważ może to uszkodzić komórki i/lub spowodować powstanie pęcherzyków powietrza. Alternatywnie, użyj pipety 20,0 µL do delikatnego wymieszania komórek: pipetuj zawiesinę tylko jeden lub dwa razy w górę i w dół.
- Nabierz objętość zawiesiny komórkowej wystarczającą tylko dla jednego miejsca wstrzyknięcia. Jeśli zaplanujesz wiele wstrzyknięć, komórki osadzą się wewnątrz strzykawki. Pobieraj komórki do strzykawki powoli, aby uniknąć pęcherzyków powietrza i/lub uszkodzenia komórek. W przypadku progenitorów glejowych, z którymi pracujemy w naszym laboratorium, wstrzykujemy 2,0 µL zawiesiny komórkowej w rozcieńczeniu 50 000-75 000 komórek na 1,0 µL w czasie 2-5 minut. Stwierdziliśmy, że 2 µL na miejsce nie powoduje uszkodzenia tkanek w szyjnym rdzeniu kręgowym. Nasze doświadczenie sugeruje jednak, że znaczne zwiększenie liczby komórek w tej objętości (szczególnie jeśli są one większe niż nasze progenitory glejowe: 10,0-20,0 µm średnicy) może spowodować uszkodzenie miąższu rdzenia kręgowego. Przeprowadziliśmy obszerny eksperyment w celu ustalenia optymalnej liczby komórek do wstrzyknięcia w każdym miejscu (przynajmniej w nienaruszonym szyjnym rdzeniu kręgowym). Parametry te muszą zostać określone dla konkretnego typu komórek i stanu chorobowego.
- Ustaw strzykawkę z igłą równolegle do osi kolumny kręgosłupa, aby precyzyjnie trafić w pożądany region anatomiczny. Igła jest ustawiona pod kątem wystarczającym (około 80 stopni względem stołu operacyjnego), aby nie uderzać w głowicę mikroskopu, ale możliwie najbliższym 90 stopniom. Obniż końcówkę w stronę powierzchni grzbietowej rdzenia kręgowego, korzystając z mikroskopu (patrz Rysunek 7).
- Skieruj igłę tuż przyśrodkowo od strefy wejścia tylnych korzonków (patrz Rysunek 8). Delikatnie dotknij końcówką igły powierzchni rdzenia kręgowego. Lekko uciśnij rdzeń kręgowy igłą. Cofnij igłę, aż rdzeń powróci do normalnego stanu. Zapisz tę pozycję jako z = 0,0, korzystając z linijki w mikromanipulatorze.
Uwaga: Rutynowo nie stabilizujemy kolumny kręgowej podczas wstrzyknięć do szyjnego rdzenia kręgowego. Przy naszym schemacie znieczulenia ruchy góra-dół szyjnego rdzenia kręgowego spowodowane głębokim oddychaniem nigdy nie stanowiły problemu. Jeśli jednak głęboki oddech jest problemem, kolumna kręgosłupa może zostać ustabilizowana za pomocą specjalnej ramy, delikatnie zaciskając kość i otaczające mięśnie przykręgosłupowe na poziomach C2 i C7 zmodyfikowanymi pęsetami, uważając, aby nie zmiażdżyć kości kręgowej ani nie uszkodzić leżącej pod nią tkanki rdzeniowej. Jeśli oddychanie zwierzęcia stanie się płytkie podczas procedury, należy podać więcej środka znieczulającego. Operację należy przerwać do czasu ponownego osiągnięcia chirurgicznej płaszczyzny znieczulenia. - Lekko wprowadź igłę do rdzenia kręgowego. Pamiętaj, aby robić to, patrząc przez mikroskop. Wprowadź igłę na głębokość 1,5 mm, aby trafić w róg przedni u dorosłych szczurów. Wprowadź igłę na głębokość 0,75 mm, aby trafić w róg przedni u dorosłych myszy (patrz Rysunek 9). Wartości głębokości są reprezentatywne dla dorosłych (co najmniej 3-miesięcznych) samic i samców szczurów Sprague-Dawley (250-450 g) oraz myszy C57BL/6 (20-35 g). Oczywiście głębokość i pozycja boczna zależą od konkretnego regionu zainteresowania. Nie poruszaj systemem wstrzykiwania, planszą ani stołem operacyjnym podczas wprowadzenia igły do rdzenia, aby uniknąć uszkodzenia tkanki rdzeniowej.
- Odczekaj dwie minuty (lub dłużej) po wprowadzeniu igły na pożądaną głębokość przed wstrzyknięciem.
- Wstrzyknij 2,0 µL w ciągu 2-5 minut ze stałą prędkością, korzystając z kontrolera pompy.
- Odczekaj dwie minuty (lub dłużej) po wstrzyknięciu przed powolnym wycofaniem igły z rdzenia kręgowego.
- Oczyść strzykawkę wodą destylowaną dH₂O po każdym wstrzyknięciu, aby zapobiec zapychaniu. Powoli nabierz i wypuść płyn 3-5 razy. Nie nabieraj powietrza do strzykawki.
- Powróć do najniższego powiększenia (takiego samego jak na początku operacji: ok. 8x). Zszyj oponę twardą szwem 9-0, choć nie jest to konieczne i jest dość trudne. W przeszłości zszywaliśmy oponę twardą, ale nie zauważyliśmy różnic w zachowaniu zwierząt, przeżywalności przeszczepów ani w histologii rdzenia kręgowego w przypadku braku szwu. Oponę twardą można przykryć ochronnym kawałkiem sterylnej gąbki żelowej. Gąbkę należy umieścić bezpośrednio nad miejscem nacięcia opony. Należy jednak uważać, aby nie odrywać gwałtownie tego kawałka gąbki z powierzchni rdzenia kręgowego podczas sekcji po perfuzji, ponieważ gąbka żelowa może czasami mocno przylgnąć do powierzchni rdzenia.
- Opcjonalnie: Zszyj mięśnie przykręgosłupowe szwem 4-0.
- Zszyj trzy powierzchowne warstwy mięśni jednocześnie szwem 4-0. Zszyj mięśnie w trzech miejscach w osi rostralno-kaudalnej (patrz Rysunek 10).
- Zamknij skórę zszywkami do ran o długości 9,0 mm (patrz Rysunek 11). Dociśnij zszywki igłotrzymaczem, aby zapobiec ich wyrwaniu przez zwierzę przed całkowitym wygojeniem rany. Rozmieść zszywki w odstępach około 0,5 cm. Nie dociągaj zbyt mocno zszywek, ponieważ może to prowadzić do upośledzenia gojenia i martwicy.
- Nałóż roztwór antyseptyczny Povidine-Iodine na obszar rany za pomocą nasączonego gazika.
- Pozostaw zwierzę do wybudzenia na podkładce z ciepłą wodą w obiegu. Bezpośrednio po operacji podaj podskórnie sterylny roztwór Lactated Ringer's (5,0 mL dla szczura; 0,5 mL dla myszy). Można podać kolejne dawki, jeśli zwierzę wydaje się odwodnione i/lub apatyczne. Można zastosować profilaktyczną antybiotykoterapię Cefazolinem w dawce 6,0 mg/kg; jednak nasze doświadczenie sugeruje, że procedura transplantacyjna nie prowadzi do infekcji pooperacyjnych, jeśli zachowana jest technika aseptyczna, a wszystkie instrumenty i materiały chirurgiczne są sterylne. Jeśli zachowane są te środki ostrożności, odradza się podawanie antybiotyków.
- Kontynuuj codzienne podawanie CSA lub FK-506/Rapamycyny aż do uśmiercenia zwierzęcia.
- Cała operacja powinna trwać mniej niż ok. 45 minut (przy 6 miejscach wstrzyknięcia). W przeciwnym razie zwierzę zacznie się budzić i oddychać intensywniej, co negatywnie wpłynie na wstrzykiwanie do rdzenia kręgowego.
Wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów związanych z poszczególnymi etapami protokołu
Brak lub słaba przeżywalność komórek: Jest to prawdopodobnie problem niezwiązany z samą techniką wstrzykiwania, lecz wynikający z właściwości wstrzykiwanego typu komórek i/lub zastosowanego schematu immunosupresji. Kwestie te muszą zostać ocenione empirycznie w zależności od typu komórek i modelu zwierzęcego. W celu uniknięcia problemów z immunosupresją można wykorzystać dostępne modele szczurów i myszy z niedoborami odporności; zwierzęta te wiążą się jednak z pewnymi trudnościami, takimi jak koszty, konieczność utrzymywania kolonii oraz potrzeba zachowania dodatkowej ostrożności podczas operacji i utrzymania w hodowli.
Deficyty funkcjonalne obserwowane po operacji: W naszym doświadczeniu nie zaobserwowaliśmy wystąpienia żadnych deficytów funkcjonalnych po tym zabiegu, ocenianych za pomocą takich miar jak siła chwytu kończyn przednich i tylnych oraz potencjały czynnościowe złożeń nerwu przeponowego/przepony, nawet przy 6 miejscach iniekcji (po 2μL każde) w odcinku szyjnym rdzenia kręgowego. Nie zaobserwowano również destrukcji tkanek. Możliwymi przyczynami wystąpienia tych problemów są: nieprzestrzeganie sugerowanego rozmiaru igły, wstrzykiwanie większych objętości i/lub liczby komórek, niezamierzone uszkodzenia spowodowane niewłaściwą laminektomią, brak delikatności podczas nacinania opony twardej (np. przytrzaśnięcie rdzenia pęsetą nr 5) lub podczas procesu wprowadzania igły Hamiltona do rdzenia kręgowego (należy wymienić tępy igłę).
Komórki nieodnalezione w brzusznej istocie szarej: Może to wynikać z szeregu przyczyn. Jeśli wtryskiwanie mija cel w kierunku przyśrodkowym lub bocznym, należy upewnić się, że system do iniekcji jest odpowiednio ustawiony równolegle do osi rdzenia kręgowego, a igłę należy wprowadzić tuż przyśrodkowo względem wejścia korzonków grzbietowych. Jeśli wtryskiwanie mija cel w kierunku grzbietowym lub brzusznym, należy upewnić się, że odczyt osi z został wyzerowany w momencie, gdy końcówka igły ledwie dotyka powierzchni grzbietowej rdzenia kręgowego, użyć zalecanej igły Hamiltona z odpowiednim ścięciem (dłuższe ścięcie może wpływać na celowanie), dopilnować, aby rdzeń kręgowy nie został uciśnięty podczas wprowadzania igły, zachować staranność przy dokładnym pomiarze głębokości za pomocą mikromanipulatora oraz używać zwierząt z zalecanego zakresu wagowego. Należy odpowiednio skorygować technikę, jeśli komórki są konsekwentnie wstrzykiwane w jedno miejsce (co wymaga oceny histologicznej i późniejszej modyfikacji techniki). Jeśli miejsca wtryskiwania są rozproszone w sposób przypadkowy, konieczne jest przeprowadzenie ćwiczeń w celu poprawy powtarzalności. Jeśli komórki mają tendencję do lokalizowania się głównie w części grzbietowej rdzenia kręgowego wzdłuż toru igły, należy wydłużyć czas oczekiwania przed i po iniekcji komórek oraz rozłożyć sam proces wtryskiwania na dłuższy czas.
4. Reprezentatywne wyniki:
Komórki progenitorowe gleju pochodzenia mysiego zostały przeszczepione (50 000 komórek/miejsce) do rogu przedniego rdzenia kręgowego na poziomie C4 u dorosłego szczura SOD1G93A. Przeszczepione komórki pochodzenia mysiego można odróżnić od tkanki gospodarza (szczura) poprzez detekcję z użyciem przeciwciała specyficznego dla myszy, M2. Obraz ten przedstawia przeżywalność komórek pochodnych z przeszczepu M2+ 1 miesiąc po transplantacji (patrz Rycina 12). Komórki zlokalizowały się w przedniej istocie szarej, jednak miejsce iniekcji w kierunku przyśrodkowym ominęło boczny róg przedni (miejsce występowania większości neuronów ruchowych nerwu przeponowego: oznaczone linią przerywaną). Przy wstrzyknięciu 50 000 komórek na miejsce nie zaobserwowano tworzenia się torbieli, a procedura iniekcji nie spowodowała upośledzenia behawioralnego. Jednakże wstrzyknięcie znacznie większej liczby komórek (faktyczna liczba różni się w zależności od typu komórek i powinna zostać systematycznie oceniona) prowadzi do uszkodzeń w miejscu iniekcji oraz wzdłuż toru igły (patrz Rycina 13: immunohistochemia z markerem astrocytów, GFAP).
Rysunek 1. Początkowe nacięcie skóry.Przy najniższym powiększeniu mikroskopu (stosujemy powiększenie 8 x), należy za pomocą ostrza skalpela wykonać nacięcie w linii środkowej. Drugą ręką rozciągnij skórę bocznie, aby była napięta (co ułatwia cięcie), a następnie wykonaj nacięcie (oznaczone grubą linią przerywaną) od podstawy czaszki (na poziomie tyłu uszu) do łopatki (oznaczonej cienką linią przerywaną).
Rycina 2. Ekspozycja pola operacyjnego.Ekspozycja chirurgiczna powinna mieć kształt kwadratu lub prostokąta. Kształt ten można uzyskać poprzez odciągnięcie otaczających mięśni w stronę 4 narożników za pomocą 4 rozszerzaczy. Do stabilizacji rozszerzaczy i zapewnienia odpowiedniego otwarcia pola należy przymocować je do stołu operacyjnego za pomocą taśmy.
Rycina 2-wstawka. Retraktory do odsłonięcia pola operacyjnego.Retraktory służą do odciągania mięśni w celu utworzenia pola operacyjnego z dobrą widocznością rdzenia kręgowego i odpowiednią przestrzenią do przeprowadzenia operacji. Retraktory można wykonać, formując wytrzymałe spinacze biurowe w pożądany kształt i rozmiar. Przed operacją należy wysterylizować retraktory w autoklawie. Do retraktora należy przywiązać sznurek.
Rysunek 3. Kręgi. Po usunięciu mięśni przykręgosłupowych należy dokładnie oczyścić powierzchnię grzbietową kręgów kleszczami kostnymi. Widoczne są poszczególne łuki kręgów, a także korzonki grzbietowe wchodzące z bocznej strony kolumny kręgosłupa.
Rycina 4. Laminektomia.Laminektomię rozpoczynamy na poziomie C5 rdzenia kręgowego. Kolumnę kręgosłupa unieruchamia się, chwytając mięśnie nad poziomem C2 za pomocą ząbkowanych pęset szczurzych. Całą blaszkę łuku (patrz schemat: chwytać w pobliżu linii środkowej) obejmuje się kleszczykami krawędziowymi. Kleszczyki należy ustawić tak, aby narzędzie było całkowicie prostopadłe do osi kolumny kręgosłupa. Powoli kruszy się blaszkę łuku. Nie wolno naciskać w stronę rdzenia kręgowego, ponieważ spowoduje to uszkodzenie tkanki rdzeniowej. Rozkruszony fragment kości należy delikatnie pociągnąć do góry. Kleszczyki powinny zmiażdżyć fragment w taki sposób, aby można go było łatwo odciągnąć i usunąć. Jeśli fragment kości jest nadal przymocowany do pozostałych blaszek łuku, nie należy go szarpać, gdyż spowoduje to krwotok i możliwe uszkodzenie rdzenia kręgowego. Kleszczyki powinny być czyste i ostre.
Rysunek 5. odsłonięcie tkanki rdzenia kręgowego po laminektomii.Rozszerzyć laminektomię, aby odsłonić cały odcinek C4-C6 rdzenia kręgowego. Wykonać jeden ciągły otwór w kości obejmujący 3 poziomy kręgowe. Nie należy rozszerzać laminektomii zbyt daleko bocznie, ponieważ spowoduje to krwotok. Aby dotrzeć do rogu przedniego, miejsce wstrzyknięcia znajduje się stosunkowo przyśrodkowo, zatem nie ma potrzeby rozszerzania laminektomii do pełnego bocznego zasięgu kości kręgu.
Rycina 6. Powiększenie powierzchni grzbietowej rdzenia kręgowego. Widoczne jest wyraźne naczynie krwionośne grzbietowe przebiegające wzdłuż linii środkowej rdzenia kręgowego. Taki układ naczyń krwionośnych obserwuje się w większości przypadków; jednak u niektórych zwierząt naczynie krwionośne przebiega poza linią środkową. Korzonki grzbietowe widoczne są w bocznych częściach powierzchni grzbietowej rdzenia kręgowego. W stosunku do opony twardej pokrywającej rdzeń kręgowy, nerwy te mają rozmyty wygląd.
Rysunek 7. Układ do iniekcji.Ustaw strzykawkę i igłę równolegle do osi kręgosłupa, aby precyzyjnie trafić w pożądany obszar anatomiczny. Igłę należy ustawić pod kątem (około 80 stopni względem stołu operacyjnego), tak aby nie uderzała ona o głowicę mikroskopu chirurgicznego, lecz była jak najbliżej kąta 90 stopni (panel lewy). Za pomocą mikroskopu opuść końcówkę igły w stronę powierzchni grzbietowej rdzenia kręgowego (panel prawy). Delikatnie dotknij końcówką igły powierzchni rdzenia kręgowego. Lekko uciśnij rdzeń igłą. Cofnij igłę, aż rdzeń kręgowy powróci do swojego normalnego, płaskiego stanu. Zapisz tę pozycję jako z = 0.0, korzystając z podziałki na mikromanipulatorze.
Rysunek 8. Duże powiększenie wstrzyknięcia do rdzenia kręgowego Nakieruj igłę tuż przyśrodkowo od strefy wejścia korzonków grzbietowych (oznaczonej linią przerywaną).
Rycina 9. Schemat rdzenia kręgowego: jak celować w interesujący region anatomiczny. Przy próbie celowania w róg przedni, należy naciąć oponę twardą równolegle do osi kręgosłupa, tuż przyśrodkowo w stosunku do strefy wejścia tylnych korzonków. Pozwoli to na dotarcie do rogu przedniego. W przypadku dorosłych szczurów igłę należy opuścić na głębokość 1,5 mm, aby trafić w róg przedni (wiek i płeć zwierzęcia nie mają istotnego wpływu na głębokość). W przypadku dorosłych myszy igłę należy opuścić na głębokość 0,75 mm, aby trafić w róg przedni. Oczywiście głębokość i pozycja boczna zależą od konkretnego regionu zainteresowania.
Rycina 10. Zamknięcie pola operacyjnego.Za pomocą nici 4-0 zszyto jednocześnie trzy nadległe warstwy mięśni. Mięśnie zszyto w trzech miejscach wzdłuż osi rostralno-kaudalnej.
Rycina 11. Staplowanie skóry.Zamknięcie skóry za pomocą klipsów do ran 9.0 mm. Zaciśnięcie zszywek za pomocą igłotrzymaczy, aby zapobiec ich wyrwaniu przez zwierzę przed pełnym zagojeniem rany. Odstępy między zszywkami powinny wynosić około 0.5 mm.
Rycina 12. Transplantacja prekursorów glejowych do szyjnego rogu brzusznego. 50 000 prekursorów glejowych pochodzenia mysiego zostało przeszczepionych do rogu brzusznego rdzenia kręgowego na poziomie C4 u szczura SOD1G93A. Komórki przeszczepione pochodzenia mysiego M2+ przeżyły po 1 miesiącu od transplantacji. Komórki zlokalizowały się w brzusznej istocie szarej, jednak miejsce iniekcji położone przyśrodkowo omijało boczny róg brzuszny (oznaczony linią przerywaną).
Rysunek 13. Uszkodzenie tkanki po transplantacji wysokiej liczby neuralnych komórek prekursorowych. Wstrzyknięcie znacznie większej liczby komórek (faktyczna liczba zależy od typu komórek i powinna zostać systematycznie oceniona) prowadzi do uszkodzeń w miejscu wstrzyknięcia oraz wzdłuż toru igły.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W badaniach z wykorzystaniem myszy i szczurów SOD1G93A należy dobrać zwierzęta w obrębie grupy pod kątem wieku i płci oraz przydzielić zwierzęta z tego samego miotu do różnych grup. W przypadku modeli ALS i SCI preferowane jest stosowanie zwierząt jednej płci, ponieważ przebieg choroby może różnić się u samców i samic; jednakże użyteczne może być również zastosowanie wystarczającej liczby zwierząt obu płci w celu wykrycia ewentualnych efektów specyficznych dla płci, gdyż zjawisko to zgłaszano w przypadku szczu...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Chciałbym podziękować: wszystkim członkom laboratoriów Lepore, Maragakis i Rothsteina za pomocne dyskusje; organizacji Paralyzed Veterans of America oraz fundacji Craig H. Neilsen za sfinansowanie badań.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| 0.05% trypsyny | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| Inhibitor trypsyny z soi (opcjonalnie) | Sigma-Aldrich | T-6522 | |
| Maleinian acepromazyny (0.7 mg/kg) | Fermenta Animal Health | ||
| Ketamina (95 mg/kg) | Fort Dodge Animal Health | ||
| Ksylazyna (10 mg/kg) | Bayer AG | ||
| Ostrze chirurgiczne typu Feather #11 | Electron Microscopy Sciences | 72044-11 | |
| Aplikatory z bawełnianą końcówką (6 cali) | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| Pinceta z ząbkami szczurzymi | Fine Science Tools | Rat: 11023-15; Mouse: 11042-08 | |
| Średnie nożyczki sprężynowe | Fine Science Tools | 15012-12 | |
| Mini nożyczki sprężynowe | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Kuszcza (rongeur) | Fine Science Tools | Rat: 16121-14; Mouse: 16221-14 | |
| Mikronóż | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Igłotrzymacze | Fine Science Tools | 12502-14 | |
| Szew: 4-0 | Vicryl | S-183 | |
| Klamry: 9 mm | Autoclip | 427631 | |
| Zszywacz: 9 mm (Reflex #203-1000) | World Precision Instruments, Inc. | 5000344 | |
| Pompa do ciepłej wody (T/Pump) | Gaymar Industries | P/N 07999-000 | |
| cyklosporyna A: ampułki 250.0 mg/5.0 mL | Novartis AG | NDC 0078-0109-01 | |
| FK-506 | LC Laboratories | F-4900 | |
| Rapamycyna | LC Laboratories | R-5000 | |
| Injektor | World Precision Instruments, Inc. | UMP2 | |
| Kontroler pompy mikrosyrgowej Micro 4 | World Precision Instruments, Inc. | UMC4 | |
| Mikromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | Kite-R | |
| Strzykawka Hamilton 10.0 μL | Hamilton Co | 80030 | |
| Igły Hamilton: 33-gauge, skos 45°, 1 cal | Hamilton Co | 7803-05 | |
| Szklane mikropipety kapilarne 20.0 μL (opcjonalnie) | Kimble Chase | 71900-20 |
Bibliografia
- Lane, M. A., Fuller, D. D., White, T. E. Respiratory recovery following high cervical hemisection. Trends in neurosciences. 31, 538-538 (2008).
- Kaplan, L. M., Hollander, D. Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis. Clin. Chest. Med. 15, 675-675 (1994).
- Miller, R. G., Rosenberg, J. A., Gelinas, D. F. Practice parameter: the care of the patient with amyotrophic lateral sclerosis (an evidence-based review): report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology: ALS Practice Parameters Task Force. Neurology. 52, 1311-1323 (1999).
- Mitsumoto, H., Chad, D. A., Pioro, E. P. Amyotrophic lateral sclerosis. Davis, F. A. , Philadelphia. (1998).
- Tandan, R., Bradley, W. G. Amyotrophic leteral sclerosis: Part 2. Etiopathogenesis. Annals of neurology. 18, 419-419 (1985).
- Bruijn, L. I., Miller, T. M., Cleveland, D. W. Unraveling the mechanisms involved in motor neuron degeneration in ALS. Annu Rev Neurosci. 27, 723-723 (2004).
- Rosen, D. R., Siddique, T., Patterson, D. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature. 362, 59-59 (1993).
- Bruijn, L. I., Becher, M. W., Lee, M. K. ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions. Neuron. 18, 327-327 (1997).
- Gurney, M. E., Pu, H., Chiu, A. Y. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
- Howland, D. S., Liu, J., She, Y. Focal loss of the glutamate transporter EAAT2 in a transgenic rat model of SOD1 mutant-mediated amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Proc Natl Acad Sci. 99, 1604-1604 (2002).
- Nagai, M., Aoki, M., Miyoshi, I. Rats expressing human cytosolic copper-zinc superoxide dismutase transgenes with amyotrophic lateral sclerosis: associated mutations develop motor neuron disease. J. Neurosci. 21, 9246-9246 (2001).
- McDonald, W., Becker, D. Spinal cord injury: promising interventions and realistic goals. Am. J. Phys. Med. Rehabi. I82, S38-S38 (2003).
- Sandrow-Feinberg, H. R., Zhukareva, V., Santi, L. PEGylated interferon-beta modulates the acute inflammatory response and recovery when combined with forced exercise following cervical spinal contusion injury. Experimental neurology. 223, 439-451 (2010).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1433 (2000).
- Lane, M. A., Lee, K. Z., Fuller, D. D. Spinal circuitry and respiratory recovery following spinal cord injury. Respiratory physiology & neurobiology. 169, 123-123 (2009).
- Lepore, A. C., Rauck, B., Dejea, C. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nature. 11, 1294-1294 (2008).
- Rao, M. S. Multipotent and Restricted Precursors in the Central Nervous System. Anat Rec. 257, 137-137 (1999).
- Rao, M. S., Mayer-Proschel, M. Glial- restricted precursors are derived from multipotent neuroepithelial stem cells. Dev Biol. 188, 48-48 (1997).
- Suzuki, M., Tork, C., Shelley, B. Sexual dimorphism in disease onset and progression of a rat model of ALS. Sexual dimorphism in disease onset and progression of a rat model of ALS. Amyotroph Lateral Scler. 8, 20-20 (2007).
- Lepore, A. C., Haenggeli, C., Gasmi, M. Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS. Brain research. 1185, 256-256 (2007).
- Veldink, J. H., Bar, P. R., Joosten, E. A. Sexual differences in onset of disease and response to exercise in a transgenic model of ALS. Neuromuscul Disord. 13, 737-737 (2003).
- Shumsky, J. S., Lepore, A. C. Transplantation of Neuronal and Glial Restricted Precursors into Contused Spinal Cord Improves Bladder and Motor Functions, Decreases Thermal Hypersensitivity, and Modifies Intraspinal Circuitry. J. Neurosci. 25, 9624-9624 (2005).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
