Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE
1. Wymagane rozwiązania
- Przygotować 150 mg/l (do znieczulenia) lub 300 mg/l (do eutanazji) roztworu metanosulfonianu etylu 3-aminobenzoesanu (MS-222) z wodą z akwarium, w którym trzymane są danio pręgowane. Napełnij mały zbiornik 1 litrem roztworu znieczulającego i utrzymuj go w stanie napowietrzenia.
- Napełnij kolejny mały zbiornik 1 litrem wody akwariowej bez MS-222 w celu odzyskania ryb i utrzymuj go napowietrzonym.
- Przygotować 50 ml 1x PBS z 10x sterylnego roztworu podstawowego.
- Do analizy cytometrycznej/izolacji komórek jelitowych należy przygotować wystarczającą ilość świeżego 0,15% roztworu kolagenazy typu IV na 1 ml na rybę z roztworu podstawowego lub z proszku w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle (DMEM) z 1% penicyliną v/v i streptomycyną (patrz materiały). Przygotować podwielokrotności (1 na rybę) po 1 ml w probówkach wirówkowych o pojemności 2 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 30 minut przed etapem sekcji.
- Do mikroskopii konfokalnej/utrwalania próbki należy przygotować 50 ml świeżego 4% roztworu paraformaldehydu (PFA) w PBS lub rozmrozić roztwór podstawowy z zamrażarki o temperaturze -20 °C w dygestorium.
ostrożność: PFA jest toksyczny. Prosimy o zapoznanie się z kartą charakterystyki substancji niebezpiecznej przed przystąpieniem do pracy z nim. Należy nosić rękawice i okulary ochronne, a roztwory zawsze pozostawiać wewnątrz dygestorium.
2. Przygotowanie sprzętu do intubacji doustnej
- Umieść około 1 cm cienkiej silikonowej rurki na igle Luer lock 31 G, aby zakryć końcówkę igły.
- Wytnij sterylną końcówkę pipety filtracyjnej o pojemności 10 μl (około 2 cm), weź cieńszy koniec i umieść go na silikonowej rurce jako osłonkę. Upewnij się, że pipeta wystaje poza końcówkę igły, aby uniknąć zranienia zwierzęcia.
- Umieścić igłę w strzykawce Luer lock o pojemności 100 μl.
nuta: Zawsze dokładnie spłukiwać alkoholem etylowym, a następnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS, patrz Materiały) między zabiegami.
3. Przygotowanie zawiesiny fluorescencyjnych nanocząsteczek
- Oznacz nanocząstkę białka estrem Atto-488 NHS (patrz Tabela materiałów) lub odpowiednim barwnikiem fluorescencyjnym zgodnie z instrukcjami producenta.
- Zawiesić nanocząstki w 0,1 M buforze wodorowęglanu sodu o stężeniu 2 mg/ml.
- Rozpuścić ester Atto 488 NHS w bezaminowym dimetylosulfotlenku (DMSO) w stężeniu 2 mg/ml. Zachowaj podwielokrotność 10 μl, aby sprawdzić skuteczność etykietowania.
- Wymieszaj nanocząstki i ester Atto 488 NHS w stosunku molowym 1:2 (białko: barwnik), mieszając w ciemności.
- Odwiruj znakowane nanocząstki przez odwirowanie przy 8 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, usuń supernatant i zachowaj go, aby sprawdzić skuteczność etykietowania.
- Przemyć oznakowane nanocząstki, umieszczając je ponownie w 1 ml 0,1 M buforu wodorowęglanu sodu poprzez wirowanie i pipetowanie w górę iw dół. Następnie odrzucić supernatant przez odwirowanie przy 8 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz krok 3.6 5 razy.
- Zawiesić osad w 5 ml 0,1 M buforu wodorowęglanu sodu w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml i wykonać porcje fluorescencyjnej nanocząstki w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml (30 podwielokrotności). Wirować w temperaturze 8 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, wyrzucić supernatant i przechowywać w temperaturze -80 °C, chronić przed światłem.
4. Znieczulenie danio pręgowanego i intubacja doustna
- Pościć rybę (>0,5 g) co najmniej 48 godzin przed eksperymentem, aby opróżnić jelito.
- Przenieś ryby (12 ryb) do zbiorników doświadczalnych (6 l) na noc przed eksperymentem, aby umożliwić aklimatyzację12.
- Dobrze zmieszać roztwór nanocząstek (np. 2 500 obr./min i 30 s) i pobrać żądaną objętość zawiesiny nanocząstek (np. 20–50 μl) do strzykawki przymocowanej do chronionej igły.
- Umieścić ryby w napowietrzonym roztworze MS-222 o stężeniu 150 mg/l (patrz sekcja 1) do momentu, aż opadną na dno zbiornika i nie będą reagować na ściśnięcie płetwy ogonowej; proces ten trwa krócej niż 5 minut.
- Szybko przenieś znieczuloną rybę za pomocą siatki na mokrą plastikową tacę, ustaw zwierzę poziomo w kierunku igły i natychmiast rozpocznij intubację doustną.
- Ostrożnie podeprzyj rybę jedną ręką i otwórz pysk drugą ręką za pomocą zabezpieczonej igły. Delikatnie wprowadzić igłę w dół przełyku na około 1 cm od otworu ustnego.
nuta: Operator może odczuwać lekki opór, gdy koniec końcówki pipety przejdzie przez skrzela. Należy uważać, aby nie ustawić wejścia igły zbyt mocno, co może spowodować perforację skrzela.
- Powoli wstrzyknąć zawiesinę nanocząstek do ryby. Upewnij się, że zawiesina nie wypływa na zewnątrz przez skrzela lub otwór gębowy.
- Delikatnie wyjąć igłę i umieścić rybę w zbiorniku rekonwalescencyjnym (patrz punkt 1). Rekonwalescencja trwa zwykle 1 minutę.
- Należy dokładnie sprawdzić rybę pod kątem nieprawidłowości (np. krwawienie ze skrzeli jest oznaką perforacji).
- Gdy ryby wyzdrowieją, zwróć je do zbiorników eksperymentalnych.
