$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Znieczulanie, intubacja i szczepienie zwierząt
UWAGA: Zalecane są wolne od specyficznych patogenów (SPF), immunokompetentne samce szczurów Sprague-Dawley o wadze 100 - 120 g. Zapewnij wszystkim zwierzętom jedzenie i wodę ad libitum i trzymaj je społecznie na zrębkach drzewnych lub innej chłonnej ściółce ze standardowymi 12-godzinnymi cyklami światła i ciemności.
- Przed przeprowadzeniem jakichkolwiek eksperymentów należy zaopatrzyć się i wysterylizować metalową kaniulę i rurkę polietylenową o rozmiarze odpowiednim dla gatunku zwierzęcia. Zaopatrz się w sterylne jednorazowe strzykawki o pojemności 1 ml i sterylne jednorazowe igły o rozmiarze 25.
ostrożność: Strzykawki i igły należy zawsze wyrzucać do pojemnika na ostre przedmioty.
- W przypadku szczurów kup lub wyprodukuj metalową kaniulę o długości około 12 cm, średnicy wewnętrznej 0,9 - 1,0 mm i średnicy zewnętrznej 1,0 - 1,2 mm i wygiętej do kąta około 45° na jednym końcu. Wytnij rurkę polietylenową o długości od 11 do 12 cali o średnicy wewnętrznej 0.4 mm i średnicy zewnętrznej 0.8 mm. (Patrz rysunek 1A.)
- Umieść metalową kaniulę w szklanej, zakręcanej probówce i autoklaw standardowymi metodami w celu sterylizacji. Namocz i przechowuj pocięte odcinki rurki polietylenowej w zakrytej zlewce zawierającej alkohol.
- Przygotuj powierzchnię roboczą i urządzenie do intubacji.
- Umieść czystą jednorazową matę na powierzchni roboczej, w pobliżu łaźni wodnej. Przenieś metalową kaniulę w szklanej rurce do przechowywania na tę powierzchnię. Zdejmij nasadkę z rurki do przechowywania i wsuń koniec "uchwytu" kaniuli do otwartego końca tubki.
- Za pomocą sterylnych kleszczy wyjmij jeden odcinek rurki polietylenowej ze zlewki i włóż ją przez wnętrze sterylnej metalowej kaniuli, upewniając się, że porusza się swobodnie. Załóż sterylną jednorazową igłę o rozmiarze 25 (dla szczurów) na wolnym końcu rurki polietylenowej, wsuwając igłę na kilka mm w rurkę. (Patrz rysunek 1A dla szczura).
- Umieść znaki prowadzące zarówno na metalowej kaniuli, jak i rurki polietylenowej, aby wskazać głębokość wprowadzenia u zwierzęcia, postępując zgodnie z opisaną poniżej procedurą intubacji na pojedynczym zwierzęciu poddanym eutanazji. Otwórz jamę klatki piersiowej w celu obserwacji, a następnie odpowiednio umieść metalową kaniulę i odpowiednio przesuń rurkę polietylenową. Za pomocą nieusuwalnego długopisu zaznacz metalową kaniulę w miejscu, w którym styka się z pyskiem zwierzęcia, oraz rurkę polietylenową w miejscu, w którym styka się z górną częścią metalowej kaniuli, aby pomóc w prawidłowym umieszczeniu w pozostałych zwierzętach.
- W dygestorium (lub przy użyciu odpowiedniego systemu oczyszczania) należy znieczulić do 6 zwierząt jednocześnie w zamkniętej komorze zasilanej ≤5% izofluranem w 1,5 l/min tlenu, aż do zahamowania odruchu wymiotnego (około 1 min).
nuta: Przed przeprowadzeniem jakichkolwiek doświadczeń należy ustalić bezpieczną dawkę i czas ekspozycji na izofluran w szczególnych stosowanych warunkach (np. wielkość/rodzaj komory i wielkość/gatunek/szczep zwierzęcia), aby zapobiec niezamierzonemu narażeniu letalnemu.
- Napełnij sterylną jednorazową strzykawkę o pojemności 1 ml (dla szczurów) sterylnym roztworem soli fizjologicznej, umieszczając sterylną końcówkę w soli fizjologicznej i pociągając ją z powrotem za tłok. Przymocować strzykawkę do igły umieszczonej na rurki polietylenowej i przepłukać całą objętość soli fizjologicznej przez rurkę, aż strzykawka zostanie opróżniona.
- Napełnić strzykawkę inokulum na bazie agaru z pojemnika w łaźni wodnej i przepłukać agar przez rurkę, aż rurka zostanie zalana (np. całkowicie wypełniona agarem).
- W przypadku szczurów wyjąć igłę o rozmiarze 25 (zamontowaną na rurki polietylenowej) z jednorazowej strzykawki. Wyrzuć zużytą strzykawkę do pojemnika na ostre przedmioty. Napełnij nową, sterylną jednorazową strzykawkę o pojemności 1 ml inokulum na bazie agaru z pojemnika w łaźni wodnej, umieszczając sterylną końcówkę w inokulum i odciągając tłok. Ponownie założyć igłę (zamontowaną na rurki polietylenowej) i przepłukać agar przez rurkę, naciskając tłok tylko do momentu, gdy rurka zostanie całkowicie wypełniona agarem.
- Usuń jedno zwierzę z komory anestezjologicznej. Ułóż zwierzę w pozycji leżącej na macie jednorazowego użytku z głową po prawej stronie i ogonem po lewej, jak pokazano na rysunku 1C.
- Za pomocą urządzenia do intubacji (tj. metalowej kaniuli wyposażonej w rurkę polietylenową) należy zaintubować zwierzę i wprowadzić kaniulę do dużego płata lewego płuca (patrz rysunek 1D).
- Włóż wolny koniec metalowej kaniuli do pyska zwierzęcia. Obróć kaniulę tak, aby wolny koniec był ustawiony pod kątem do góry i delikatnie wsuń ją do tchawicy, ostrożnie omijając struktury krtani lekkim ruchem skręcającym. Potwierdź wprowadzenie do tchawicy, a nie do przełyku, delikatnie przesuwając kaniulę lekko do przodu i do tyłu kilka razy, jednocześnie dotykając pierścieni tchawicy lewym palcem wskazującym, jak pokazano na rysunku 1C.
- Gdy kaniula dotrze do rozwidlenia, w którym tchawica rozdziela się na lewe i prawe oskrzel, wykonaj lekki ruch skręcający w kierunku lewej strony zwierzęcia, aby upewnić się, że kaniula została wprowadzona do lewego oskrzela. Przesuń metalową kaniulę do momentu, aż koniec znajdzie się w połowie lub trzech czwartych w dół lewego płuca, używając wcześniej umieszczonego znacznika prowadzącego, aby potwierdzić, że osiągnięto odpowiednią głębokość.
- Po założeniu metalowej kaniuli przesuń rurkę polietylenową o kilka mm. Użyj wcześniej umieszczonego znacznika prowadzącego na rurce, aby upewnić się, że jest ona wysunięta tylko na tyle daleko, aby wyjść z końca metalowej kaniuli i nie przebić płuca.
- Mając obie kaniule na miejscu, użyj dołączonej strzykawki, aby wkroplić 100 μl (dla szczurów) zawiesiny agarowej głęboko do dużego płata lewego płuca (patrz rysunek 1D). Wyciągnąć kilka mm rurki polietylenowej, a następnie delikatnie wyjąć nienaruszone urządzenie do intubacji. Umieść go z powrotem w szklanej tubie do przechowywania i przenieś zwierzę do nowej klatki, aby wyzdrowiało.
