Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie ekstraktu z gruczołów łzowych
UWAGA: Szczury zostały znieczulone dootrzewnowym wstrzyknięciem ketaminy (75 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg). Prawidłowe znieczulenie zostało potwierdzone przez szczypanie palców u nóg i ogonów. Żel okulistyczny nakładano na oczy szczura, aby zapobiec wysuszeniu po każdym zabiegu. Znieczulone szczury umieszczono pod światłem dalekiej podczerwieni, aby utrzymać zwierzęta w cieple, dopóki w pełni nie wyzdrowieją. Podczas zabiegów i czasu rekonwalescencji zwierzęta były ściśle monitorowane przez badaczy. Wszystkie materiały i narzędzia chirurgiczne były sterylne przed użyciem. Pod koniec eksperymentu szczury poddano eutanazji poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu (80 mg/kg). Całkowita eutanazja została zweryfikowana przez brak tętna serca i brak odruchu mrugania przez dotknięcie gałki ocznej. Szczury trzymano w standardowych warunkach: temperatura pokojowa, 21-23 °C; wilgotność względna, 30-70%; cykl jasny i ciemny, na przemian 12 godzin (od 7 rano do 7 wieczorem).
- Ułóż poddane eutanazji samice szczurów Sprague-Dawley (w wieku od 8 tygodni do 16 tygodni) płasko, jednym uchem opartym o stół, a drugim skierowanym do góry. Wykonaj 10-milimetrowe nacięcie góra-dół pod odsłoniętym uchem za pomocą nożyczek sprężynowych. Usunąć gruczoł łzowy, wycinając go z otaczającej tkanki łącznej i z kanału drenażowego.
- Przechowywać gruczoły w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będą potrzebne. Rozmrozić gruczoły na lodzie. Zmiel jak najdrobniej na lodzie nożyczkami. Dodać 150 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami lub PBS z 1x inhibitorem proteazy na gruczoł łzowy.
- Sonikować próbki na lodzie przez 5 minut przy 20 kHz z sonatorem ustawionym na 10 s i 10 s wyłączonym na 30% amplitudzie. Odwirować próbki poddane sonikacji przez 20 minut w temperaturze 13 000 x g i temperaturze 4 °C.
- Odpipetować supernatant i przenieść go do nowej probówki. Porcję supernatantu rozmieścić w probówkach o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C. Zmierzyć stężenie białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego, zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Przygotowanie emulsji i toksyny krztuścowej
- emulsja
- Dodać 40 mg zabitego termicznie Mycobacterium tuberculosis H37Ra do 10 ml kompletnego adiuwantu Freunda zawierającego 1 mg/ml Mycobacterium tuberculosis H37Ra i dobrze wymieszać.
nuta: Końcowy kompletny adiuwant Freunda zawiera 5 mg/ml Mycobacterium tuberculosis H37Ra.
- Zważyć albuminę jaja kurzego, rozpuścić ją w PBS i przygotować mieszaninę antygenów zawierającą 2 mg/ml albuminy jaja kurzego i 10 mg/ml ekstraktu z gruczołów łzowych. Dążąc do uzyskania objętości iniekcji wynoszącej 200 μl dla każdego zwierzęcia, należy przygotować mieszankę wzorcową na podstawie liczby zwierząt.
- Przenieść niekompletny adiuwant Freunda lub kompletny adiuwant Freunda do probówki o pojemności 50 ml, upewniając się, że objętość adiuwantu do mieszaniny antygenów jest w stosunku 1:1. Dodawać mieszaninę antygenu kropla po kropli do adiuwanta, wirując z największą prędkością, aby nie spowodować rozlania. Kontynuuj wirowanie przez 5 minut po dodaniu całego antygenu.
- Przenieść emulsję do strzykawki o pojemności 5 ml i połączyć ją z inną strzykawką o pojemności 5 ml przez łącznik strzykawki. Przepchnąć emulsję z jednej strzykawki do drugiej, aby ją wymieszać.
nuta: Emulsja jest gotowa, jeśli pojedyncza kropla pozostanie jako kula po umieszczeniu w wodzie. Należy stosować wyłącznie świeżo przygotowaną emulsję lub emulsję przechowywaną przez noc w temperaturze 4 °C.
- Toksyna krztuścowa
- Rozpuść 50 μg toksyny krztuścowej w 500 μl wody, aby uzyskać końcowe stężenie 100 ng/μl. Votex pojemnik należy rozpuścić przez 30 sekund, aby upewnić się, że toksyna całkowicie się rozpuści.
nuta: Nie sterylizuj przez filtrację, ponieważ spowoduje to utratę materiału. Nie zamrażać. Roztwór ten pozostaje aktywny przez co najmniej 6 miesięcy w temperaturze 4 °C.
- Rozcieńczyć 100 ng/μl toksyny krztuścowej do 3 ng/μl za pomocą PBS. Przenieść 100 μl rozcieńczonej toksyny krztuścowej do 1 ml strzykawki do wstrzykiwań Luer-lock za pomocą igły 27 G.
3. Szczepienia szczurów Lewisa
- W dniu 0 wymieszaj emulsję kilka razy. Rozprowadzić 200 μl emulsji, która zawiera 1 mg ekstraktu z gruczołów łzowych i 200 μg albuminy jaja kurzego w kompletnym adiuwantie Freunda, do 1-mililitrowych strzykawek Luer-lock z igłami 27G. Emulsję wstrzyknąć podskórnie u podstawy ogonów szczura bez znieczulenia.
nuta: Ogon nie musi być wstępnie rozgrzany przed wstrzyknięciem. Każdy szczur jest uodparniany 1 mg ekstraktu z gruczołów łzowych i 200 μg albuminy jaja kurzego w kompletnym adiuwant Freunda z 500 μg Mycobacterium tuberculosis H37Ra.
- W dniu 14 wstrzyknąć 200 μl emulsji, która zawiera 1 mg ekstraktu z gruczołów łzowych i 200 μg albuminy jaja kurzego w niekompletnym adiuwant Freunda, w taki sam sposób, jak w dniu 0. Wstrzyknąć 300 ng toksyny krztuścowej do 100 μl PBS dootrzewnowo na szczura tego samego dnia.
4. Wstrzyknięcie mieszaniny antygenu do spojówki otworu i gruczołu łzowego w celu rekrutacji komórek odpornościowych specyficznych dla antygenu i wywołania miejscowego stanu zapalnego
- Oblicz ilość albuminy jaja kurzego i ekstraktu z gruczołów łzowych na podstawie liczby szczurów w eksperymencie. Zważyć wymaganą ilość albuminy jaja kurzego i połączyć ją z rozmrożonym ekstraktem gruczołu łzowego przygotowanym w kroku 1, tworząc roztwór antygenu zawierający 1 mg/ml albuminy jaja kurzego i 1 mg/ml ekstraktu z gruczołów łzowych.
- Znieczulić szczury ketaminą (75 mg/kg) i ksylazyną (10 mg/kg) we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Uszczypnij palce u nóg szczurów, aby upewnić się, że uzyskano odpowiednie znieczulenie (tj. po uszczypnięciu nie obserwuje się żadnego ruchu reagującego). Wstrzyknąć 5 μl antygenu do spojówki podspojówkowej otworu oka. Wstrzyknąć 20 μl antygenu do gruczołu łzowego.
5. Ocena cech zespołu suchego oka
UWAGA: Znieczulone szczury powinny być delikatnie trzymane ręką w rękawiczce w pozycji pionowej na płaskiej powierzchni, aby uniknąć ruchu.
- Zmierz objętość łez za pomocą czerwonej nici fenolowej.
- Użyj jednej pary kleszczy do przytrzymania nici, a drugiej, aby pociągnąć dolną powiekę szczura. Umieść nić w proksymalnym rogu dolnej półki na 1 minutę, a następnie usuń nić.
nuta: Łzy sprawiają, że zwilżona część nici ma czerwony kolor.
- Zrób zdjęcie długości zwilżonej części nici obok linijki z oznaczeniami milimetrowymi. Zmierz długość zwilżania z dokładnością do dziesiątej części milimetra za pomocą oprogramowania do obrazowania (np. ImageJ).
- Zmierz gładkość rogówki/rozdarcia.
- Umieść szczura pod mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w oświetlacz pierścieniowy i kamerę. Nałóż 5 μl soli fizjologicznej na rogówkę szczura. Mrugaj biernie, przesuwając górną i dolną powiekę palcami w rękawiczce ~5 razy, aby rozprowadzić sól fizjologiczną.
- Ustaw oświetlacz pierścieniowy na środku powierzchni rogówki pod powiększeniem 1.6x. Uzyskuj obrazy fotograficzne po 10 s.
nuta: Iluminator pierścieniowy wyświetla dwa okrągłe rzędy obrazów punktowych na rogówkach zwierzęcia. Regularne odstępy między niezniekształconymi kropkami sugerują gładką warstwę rogówki/łzy.
