Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Wysiewanie komórek otrzewnowej w szkiełkach kanałowych
- Po pipetowaniu zawiesiny mysich komórek makrofagowych otrzewnowej w górę i w dół w celu zmniejszenia zbrylania, należy odpipetować 100 μl zawiesiny do wstępnie napełnionego kanału (objętość, 100 μl) szkiełka kanałowego pokrytego fibronektyną (kanał o pojemności 100 μl ma wymiary (długość x szerokość x wysokość): 50 mm x 5 mm 0,4 mm).
- Wstępnie napełnij komorę, dodając 1 ml pożywki RPMI 1640 (Hepes) uzupełnionej surowicą do jednego z dwóch zbiorników suwaka kanałowego, przechylając szkiełko, a następnie zasysając medium z dolnego zbiornika (rysunek 1).
- Usuń niechciane pęcherzyki powietrza lub długie paski powietrza z kanału, dodając 1–2 ml pożywki do jednego z dwóch zbiorników, szczelnie nakładając korek zbiornika, a następnie wypompowując powietrze poprzez rytmiczny nacisk kciuka na nasadkę i, w razie potrzeby, przechylając szkiełko. Po wydaleniu powietrza przechyl suwak z niezakorkowanym zbiornikiem (i zawierającym medium) w dół przed zdjęciem korka, aby uniknąć zasysania powietrza z powrotem do kanału.
- Inkubować szkiełko kanałowe, wysiane komórkami, w wilgotnej komorze przez 2 godziny w temperaturze 37 °C przy braku CO2 (CO2 nie jest wymagane, ponieważ system buforowy HCO3-/CO2 został zastąpiony przez Hepes). Prowadnice kanałowe można wygodnie umieścić na stojaku, który mieści osiem prowadnic. Zazwyczaj z jednej myszy przygotowuje się 6–8 slajdów, chociaż możliwe jest do 10 lub więcej.
- Wyjąć stojak i wymienić pożywkę RPMI 1640 (Hepes) w każdym szkiełku na pożywkę RPMI 1640 zawierającą wodorowęglan, uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą, a także penicyliną/streptomycyną.
- Przechylić suwak i zassać medium najpierw z dolnego zbiornika, a następnie z górnego zbiornika. Następnie dodaj 1 ml nowej pożywki do jednego ze zbiorników, przechyl szkiełko i zassaj pożywkę z dolnego zbiornika, po jej przepłynięciu przez kanał.
- Po tym etapie płukania (wymiany medium) napełnij szkiełko kanałowe, dodając 1 ml pożywki do jednego ze zbiorników.
nuta: Mycie etapów za pomocą szkiełek kanałowych jest bardzo proste i skuteczne pod względem wymiany roztworu i usuwania nieprzylegających komórek. Należy pamiętać, że pożywka RPMI 1640 (wodorowęglanowa) jest zwykle wstępnie inkubowana z 5% CO2 przez noc, aby zapewnić równowagę termiczną i pH.
- Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze z 5% CO2 . Wykonaj eksperymenty następnego dnia.
2. Izolacja ludzkich czerwonych krwinek
- W drugim dniu (drugi dzień eksperymentów; po całonocnej inkubacji izolowanych makrofagów otrzewnej) należy pobrać 1-2 ml krwi żylnej obwodowej od zdrowego dawcy do probówki z heparyną. Przenieść 1 ml do okrągłej probówki wirówkowej o pojemności 2,0 ml (polipropylenu), odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 18 °C (ustawienie empiryczne) i usunąć supernatant (osocze i kożuch).
- Delikatnie odessać 100 μl osadzonych krwinek czerwonych i wymieszać tę objętość 1:1 ze zmodyfikowaną pożywką RPMI 1640 (Hepes) (opisaną poniżej) w probówce mikrowirówkowej o okrągłym dnie 2,0 ml. Oznacz rurkę "1:1".
nuta: Pożywka RPMI 1640 (Hepes) stosowana w 2. dniu (do testów) po wyizolowaniu komórek zawiera, oprócz 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej, penicylinę (100 jednostek/ml), streptomycynę (100 μg/ml) i 1 mM N-(2-merkaptopropionylo)glicynę (w celu zmniejszenia fototoksyczności). W dalszej części tego medium określa się mianem "zmodyfikowanego" medium RPMI 1640 (Hepes).
- Odpipetować 4 μl rozcieńczonej w stosunku 1:1 zawiesiny krwinek czerwonych do 2 ml zmodyfikowanego podłoża RPMI 1640 (Hepes), wstępnie odpipetowanego do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml (powtórzyć ten krok, tj. przygotować 2 probówki). Oznacz każdą probówkę jako "4:2000". Umieść probówki "1:1" i "4:2000" na lodzie.
3. Etykietowanie błony plazmatycznej makrofagów
- Wyjmij szkiełka z kanałami zasiewnymi z inkubatora CO2 i wymień pożywkę RPMI 1640 (wodorowęglan) w każdym szkiełku na zmodyfikowaną pożywkę RPMI 1640 (Hepes). Następnie umieścić komórki w wilgotnej komorze o temperaturze 37 °C pod nieobecność CO2,
nuta: Po całonocnej inkubacji i myciu większość limfocytów jest usuwana z kanału. Większość pozostałych przylegających komórek to makrofagi, które można zidentyfikować morfologicznie lub przez barwienie immunofluorescencyjne przy użyciu przeciwciała anty-F4/80. Około 95% makrofagów otrzewnowych rezydujących u myszy jest F4/80 dodatnich.
- Rozcieńczyć fluorescencyjnie zielone znakowane przeciwciało anty-mysie F4/80 (przechowywane w temperaturze 4 °C) w stosunku 1:40 w zmodyfikowanym pożywce RPMI 1640 (Hepes). Wziąć szkiełko, przechylić je i odpipetować (kropla po kropli) 100 μl mieszaniny przeciwciał do otworu kanału 100 μl szkiełka (patrz rysunek 1). Zassać pożywkę, która wpływa do zbiornika znajdującego się za nim. Inkubować komórki przez 20 minut w temperaturze 37 °C (wilgotne środowisko, bez CO2 ). W okresie inkubacji oznaczyć ludzkie krwinki czerwone (patrz punkt 5).
nuta: Jak wspomniano powyżej, CO2 nie jest wymagany, ponieważ system buforowy HCO3-/CO2 został zastąpiony przez Hepes.
- Po 20 minutach inkubacji (podczas których ludzkie krwinki czerwone są barwione i opsonizowane), umyj szkiełko, dodając 1 ml zmodyfikowanej pożywki RPMI 1640 (Hepes) do jednego ze zbiorników i zasysając pożywkę po jej przepłynięciu przez kanał, co jest możliwe dzięki przechyleniu szkiełka. Dodać 1 ml pożywki do krótkotrwałego przechowywania lub przystąpić do eksperymentu (tj. pipetowania cząstek (opsonizowanych czerwonych krwinek) i obrazowania fagocytozy za pomocą poklatkowej mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem).
4. Oznaczanie błony komórkowej ludzkich czerwonych krwinek
- Znakowanie ludzkich krwinek czerwonych należy rozpocząć natychmiast po inkubacji szkiełka z makrofagów zielonym fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem anty-F4/80 (po sekcji 3.2). Po delikatnym wymieszaniu pobrać 400 μl z jednej z probówek "4:2000" (patrz sekcja 2.3) i przelać je do (okrągłego dna) probówki wirówkowej o pojemności 2,0 ml. Odczekać, aż zawiesina ogrzeje się do temperatury około 37 °C (patrz akapit poniżej). Dodać 0,4 μl pomarańczowego/czerwonego fluorescencyjnego barwnika plazmatycznego (podwielokrotności przechowywane w temperaturze -20 °C), wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 min.
nuta: Podgrzewany blok aluminiowy, umieszczony wewnątrz okapu z przepływem laminarnym, jest przydatny do minimalizowania strat ciepła podczas przygotowywania szkiełek. Rury można umieszczać w studzienkach wiertniczych bloku grzewczego, a oddzielna lub zintegrowana, podgrzewana płyta aluminiowa może służyć jako przestrzeń robocza.
- Po 5-minutowym okresie inkubacji należy przygotować pierwszy etap płukania, dodając 1600 μl zmodyfikowanej pożywki RPMI 1640 (Hepes) (w celu napełnienia probówki mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml).
- Odwirować probówkę o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze 18 °C (ustawienie empiryczne). Zwarta czerwona granulka powinna być widoczna na ścianie (tj. poza środkiem) na dnie tuby. Obrócić probówkę tak, aby osad był skierowany do góry i ostrożnie usunąć kolejno (w dwóch etapach) cały supernatant za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1–1,5 ml.
- Po zassaniu supernatantu dodać 2 000 μl zmodyfikowanej pożywki RPMI 1640 (Hepes), wymieszać (w celu ponownego zawieszenia komórek) i powtórzyć powyższe etapy wirowania i aspiracji supernatantu.
- Zawiesić osad (z błony plazmatycznej barwionej i 2x przemyte czerwone krwinki) z 400 μl zmodyfikowanego podłoża RPMI 1640 (Hepes). Oznacz probówkę PMS (skrót od barwienia błony plazmatycznej).
nuta: Alternatywnie, ester sukcynimidylowy pochodnej rodaminy wrażliwej na pH, który staje się silniej fluorescencyjny w kwaśnym pH, może być użyty do znakowania ludzkich czerwonych krwinek. W tym przypadku intensywność fluorescencji służy dodatkowo jako miara dojrzewania fagosomu po internalizacji cząstek.
5. Opsonizacja (znakowanie) ludzkich czerwonych krwinek za pomocą mysiej immunoglobuliny G (IgG)
- Dodać 1 μl mysiego (IgG2b) monoklonalnego (klonu HIR2) przeciwciała anty-ludzkiego CD235a (1 mg/ml) (przechowywanego w temperaturze -20 °C) do probówki znakowanej PMS (patrz punkty 4.2–4.5), zawierającej barwione błoną plazmatyczną ludzkie krwinki czerwone zawieszone w pożywce o objętości 400 μl. CD235a (znana również jako glikoforyna A) jest błonową sialoglykoproteiną specyficzną dla linii erytroidalnej.
- Inkubować w temperaturze 37 °C przez 8 minut. Należy pamiętać, że opsonizacja ludzkich krwinek czerwonych za pomocą IgG powoduje aglutynację (zlepianie się komórek). Chociaż aglutynacja może służyć jako wizualny wskaźnik opsonizacji, jest niepożądana w przypadku obrazowania pojedynczych efektów fagocytarnych. Aby obejść aglutynację, należy wielokrotnie mieszać zawiesinę komórek (co 1 minutę), używając na przykład pipety o zmiennej objętości 20–200 μl ustawionej na 200 μl.
- Pod koniec 8-minutowego okresu inkubacji, jeśli jest to pożądane, umyć szkiełko makrofagowe, inkubowane z zielonym fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem anty-F4/80, z 1 ml zmodyfikowanej pożywki RPMI 1640 (Hepes). Upewnij się, że oba zbiorniki zjeżdżalni kanałowej są wolne od medium po etapach mycia.
6. Obrazowanie fagocytozy ludzkich krwinek czerwonych barwionych błoną plazmatyczną i pokrytych IgG
- Po 8 minutowej inkubacji z przeciwciałem anty-CD235a (sekcja 5.2), odpipetować 100 μl zawiesiny zawierającej barwione błoną plazmatyczną i IgG-opsonizowane ludzkie krwinki czerwone do kanału szkiełka zawierającego makrofagi znakowane zielonym fluorescencyjnym przeciwciałem anty-F4/80 (etap 3). W ten sposób czerwone fluorescencyjne, opsonizowane IgG ludzkie krwinki czerwone są dodawane do zielonych fluorescencyjnych fagocytów (makrofagów).
- Jak tylko ludzkie krwinki czerwone zostaną dodane, zamontuj szkiełko kanałowe na mikroskopie konfokalnym z wirującym dyskiem (z inkubatorem stage ustawionym na 37 °C) w celu obrazowania, na przykład przez soczewkę obiektywową 60X/1,49 zanurzoną w olejku. Rozpocznij obrazowanie tak szybko, jak to możliwe, ponieważ cząstki zaczynają osiadać w ciągu 1 minuty.
nuta: Za pomocą kulek fluorescencyjnych o średnicy 100 nm zmierzyliśmy, poprzez analizę funkcji rozrzutu punktowego, rozdzielczości XY x = 0,22 μm, y = 0,23 μm (laser 488 nm) oraz x = 0,27 μm, y = 0,27 μm (laser 561 nm). Jednak, aby zmniejszyć fotobielenie i fototoksyczność podczas poklatkowego obrazowania 3D żywych komórek, obniżyliśmy rozdzielczość przestrzenną za pomocą binningu 2 x 2. Binning zwiększa czułość (poprawia stosunek sygnału do szumu) i dopuszczalną liczbę klatek na sekundę, ale kosztem rozdzielczości przestrzennej.
- Użyj idealnego systemu ustawiania ostrości (lub podobnego), aby zapobiec dryfowaniu ostrości podczas nagrywania. Po aktywacji systemu idealnego ustawiania ostrości użyj kontrolki przesunięcia, aby ustawić ostrość na blaszkowatych występach makrofagów bezpośrednio nad szkiełkiem nakrywkowym (patrz uwaga poniżej) szkiełka kanałowego. Ten poziom ostrości odpowiada Z = 0 μm. Uzysk stosy Z od -1 μm do +16 μm w krokach co 0,8 μm, co daje 22 warstwy Z. Stosy Z można na przykład uzyskać w tempie 1 stosu (na każdy kanał) co 15 s, co daje w sumie 16 min.
nuta: Dłuższe okresy nagrywania cierpią z powodu utraty jakości obrazu, głównie z powodu fotowybielania. Stosy Z są rejestrowane dla każdego z dwóch kanałów: makrofagi są obrazowane za pomocą lasera o długości fali 488 nm (kanał zielony), a ludzkie krwinki czerwone są obrazowane za pomocą lasera o długości fali 561 nm (kanał czerwony). Stosując to podejście, można uzyskać różne widoki makrofagów spożywających ludzkie krwinki czerwone opsonizowane IgG w różnych punktach czasowych (na przykład patrz Rysunek 2).
nuta: Typowe ustawienia systemu (z binningiem 2 x 2) to: kanał zielony (moc lasera 20,5% (50 mW; 488 nm), czułość 101 (zakres, 0–255) i czas naświetlania 200 ms); kanał czerwony (moc lasera 10,5% (50 mW; 561 nm), czułość 101 (zakres, 0-255) i czas naświetlania 98 ms).
nuta: Dno prowadnicy kanałowej jest wykonane z polimeru o tej samej grubości co szkiełko nakrywkowe #1,5 i tych samych właściwościach optycznych szkła, ale warto zauważyć, że materiał ten ma tę zaletę, że zapewnia przepuszczalność gazów.
