Barwienie kalceiną acetoksymetylową w celu oceny cytotoksyczności komórek NK w stosunku do komórek rakowych

Streszczenie

Źródło: Chava, S. et al., Pomiar cytotoksyczności i migracji komórek NK w kontekście komórek nowotworowych wątroby. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film demonstruje test do pomiaru cytotoksyczności komórek NK przeciwko komórkom rakowym za pomocą barwienia Calcein AM. Zmniejszona liczba fluorescencyjnych komórek nowotworowych po jednoczesnej hodowli z komórkami NK wskazuje na cytotoksyczność komórek NK w stosunku do komórek nowotworowych.

Protokół

1. Mikroskopowa metoda barwienia kalceiny AM do pomiaru cytotoksyczności za pośrednictwem komórek NK

1. Hodowla komórek SK-HEP-1 do konfluencji 70−80%. Wygeneruj zawiesinę jednokomórkową, najpierw myjąc komórki 5 ml 1x PBS, a następnie inkubując z 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA.
2. Odwirować komórki SK-HEP-1 w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 1 ml przy 160 x g przez 3 minuty. Zawiesić osad w 3 ml DMEM bez surowicy.
3. Dodać 1,5 μl roztworu kalceiny AM (10 mM) do komórek SK-HEP-1 i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Odwirować komórki SK-HEP-1 znakowane kalceiną AM przy 160 x g przez 3 minuty w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
4. Umyj komórki dwukrotnie 5 ml 1x PBS, aby usunąć nadmiar barwnika kalceiny AM.
5. Równolegle odwiruj komórki NK92MI o masie 160 x g przez 3 minuty w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Umyj osad komórkowy raz 5 ml 1x PBS i ponownie zawieś w 5 ml pożywki komórkowej NK92MI.
6. Policz komórki SK-HEP-1 znakowane kalceiną AM i komórki NK92MI za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
7. Ponownie zawiesić komórki SK-HEP-1 w pożywce hodowlanej w stosunku 1 x 10⁵ komórek/ml i komórki NK92MI w pożywce 1 x 10⁶ komórek/ml w pożywce komórkowej NK.
8. Komórki SK-HEP-1 znakowane kalceiną AM (komórki docelowe) (1 x 10⁴/100 μL / dołek) z komórkami NK92MI (komórki efektorowe) (1 x 10⁵/100 μL / dołek) (stosunek 1:10 cel: efektor) na dołek w trzech dołkach na płytce 96-dołkowej.
9. Inkubować 96-dołkowe płytki w temperaturze 37 °C w atmosferze 95% powietrza i 5% CO₂ przez 4 godziny. Po inkubacji uchwyć obrazy fluorescencyjne komórek znakowanych kalceiną AM za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy 10-krotnym powiększeniu. Przechwyć co najmniej 10 różnych pól każdej kontrpróby dla każdego warunku leczenia.
10. Losowo wybierz 10 obrazów dla każdej kontrpróby i policz komórki docelowe znakowane kalceiną AM-dodatnie inkubowane z komórkami NK92MI lub bez nich. Obliczyć % cytotoksyczności, korzystając z poniższego wzoru.
    
    nuta: Jako kontrole użyj komórek docelowych bez komórek NK92MI i całkowicie zlizowanych komórek docelowych jako pełnej kontroli lizy. Aby uzyskać pełną lizę, inkubować komórki w 0,5% Triton X-100 przez 1 godzinę (20 μL 5% Triton X-100 w 200 μl pożywki hodowlanej).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Barwnik Calcein AM	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 17783
DMEM (DMEM)	Gibco (firma Gibco)	11965-092
Surowica bydlęca płodu	Gibco (firma Gibco)	26140079
Surowica końska	Gibco (firma Gibco)	16050114
Ogniwa NK92MI	Kontroler ATCC (Kontroler T	CRL-2408
Bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P4417
Ogniwa SKHEP-1	Kontroler ATCC (Kontroler T	Zobacz materiał HTB-52
Roztwór trypsyny EDTA	Gibco (firma Gibco)	25200056

powiedział: