Pomiar migracji komórek NK w odpowiedzi na bodźce chemotaktyczne

Streszczenie

Źródło: Chava, S., et al. Pomiar cytotoksyczności i migracji komórek NK w kontekście komórek nowotworowych wątroby. J. Vis. Exp. (2020).

Ten film demonstruje metodę badania migracji komórek NK (natural killer) przez system wstawiania porowatej błony w odpowiedzi na chemoatraktanty. Metoda ta umożliwia ilościową analizę migracji komórek NK z wykorzystaniem cytometrii przepływowej.

Protokół

1. Test migracji komórek NK

1. Hoduj komórki NK92MI i odwiruj komórki w 160 x g przez 3 minuty w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
2. Umyj osad komórkowy dwukrotnie 5 ml 1x PBS i ponownie zawieś komórki w 3 ml pożywki komórkowej NK92MI bez surowicy. Policz komórki NK92MI za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
3. Płytka komórek NK92MI (2,5 x 10⁵ komórek/100 μL/dołek) w górnej komorze przepuszczalnej komory transwell (wkładka o średnicy 6,5 mm i wielkości porów 5 μm).
4. Do dolnej komory dodać 0,6 ml bezsurowicowej pożywki zawierającej materiał do badania właściwości chemoatraktantu komórek NK (np. kondycjonowana pożywka, chemokiny, cytokiny).
   nuta: Przygotowując kondycjonowaną pożywkę, należy użyć pożywki o zredukowanej surowicy bez dodatku surowicy, aby wyeliminować interferencję białek surowicy w teście migracji.
5. Inkubować 24-studzienkowo przepuszczalne komory w temperaturze 37°C przez 4 godziny. Po 4 godzinach zebrać nieprzylegające i zmigrowane komórki NK92MI z dolnej komory i przenieść je do probówek do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) w celu dalszej analizy.
   nuta: Czas hodowli może się różnić w zależności od rodzaju komórek docelowych, a także ilości i kinetyki chemokin wytwarzanych przez komórki docelowe. Dlatego czas ten powinien być empirycznie określony dla każdego typu komórki, chemokiny i eksperymentu.
6. Dodać z góry określoną liczbę kulek liczących do cytometrii przepływowej w objętości 50 μl do każdej probówki zawierającej migrowane komórki NK. Ocenić objętość zawiesiny komórek o objętości 300 μl/studzienkę za pomocą dowolnego cytometru przepływowego zdolnego do automatycznego zliczania komórek opartego na FACS.
   nuta: Za każdym razem przed użyciem dokładnie wymieszać lub wymieszać wirowo kulki liczące do cytometrii przepływowej, aby upewnić się, że używana jest stała liczba kulek w celu zminimalizowania zmienności eksperymentalnej. Zaleca się pipetowanie odwrotne z kulkami zliczającymi w celu zachowania dokładności. Używaj tylko komórek NK i kulek zliczających do cytometrii przepływowej jako kontroli analizy FACS. Autorzy zalecają przeczytanie co najmniej 10 000 koralików + komórek NK łącznie, co dobrze się sprawdziło. Liczba ta może się jednak różnić w zależności od warunków eksperymentalnych. Dlatego łączna liczba kulek + komórek NK powinna być empirycznie określona dla każdego rodzaju eksperymentu. Ponadto ważne jest, aby przeprowadzać eksperymenty z użyciem biologicznych triplikatów, aby osiągnąć statystycznie istotne wyniki i uwzględnić zmienność między różnymi liczbami komórek.
7. Oblicz bezwzględną liczbę migrowanych komórek NK92MI za pomocą tego wzoru:
   
   gdzie A = liczba komórek, B = liczba kulek, C = przypisana liczba kulek w partii (liczba kulek zliczających dla cytometrii przepływowej/50 μL; w tym przykładzie 49 500), a D = objętość próbki (μL).
   nuta: Jeśli do analizy FACS używa się 300 μl objętości próbki (migrowane komórki) z 50 μl kulek zliczających do cytometrii przepływowej, bezwzględna liczba migrowanych komórek = 1 700 komórek / 3 300 zdarzeń kulek x 49 500 kulek / 300 μl = 84,975 komórek / μl. Obliczenia należy skorygować, jeśli próbka jest rozcieńczona lub jeśli stosuje się różną objętość kulek do liczenia FACS.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Koraliki do liczenia bezwzględnego	Thermo Fisher Naukowy	Zobacz materiał C36950
Ogniwa NK92MI	Kontroler ATCC (Kontroler T	CRL-2408
Ogniwa SKHEP-1	Kontroler ATCC (Kontroler T	Zobacz materiał HTB-52
Komory przepuszczalne Transwell	Costar	3241
Opti-MEM	Gibco (firma Gibco)	31985070
Bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P4417
Alfa-MEM	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M4256

powiedział: SZT.