$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie dopełniacza i docelowej bakterii
- Przygotuj uzupełnienie dla małego królika (BRC)
UWAGA: Szczegółowe kryteria doboru partii uzupełniających można znaleźć tutaj: https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf
- Uzyskaj zamrożony BRC i rozmrozić pod bieżącą zimną wodą. Fizycznie mieszaj BRC co ~10-20 minut, aż do całkowitego rozmrożenia. Nie poddawaj BRC powtarzającym się cyklom zamrażania i rozmrażania.
- Podczas rozmrażania BRC oznacz probówki wirówkowe o pojemności 1.5 ml, 5 ml lub 15 ml. Umieść oznaczone rurki na lodzie, aby wstępnie ostygły. Porcję odpowiedniej objętości BRC do wstępnie schłodzonych probówek wirówkowych (po napełnieniu natychmiast zawróć każdą probówkę do lodu). Porcje należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze ≤ -70 °C.
nuta: Na każdą płytkę testową potrzeba około 1 ml dopełniacza. Podwielokrotności dopełniacza są przeznaczone do jednorazowego użytku i powinny być podawane w objętościach odpowiednich dla układów testów.
- Aby przygotować inaktywowany termicznie BRC, rozmrozić jedną porcję aktywnego BRC. Przygotować łaźnię wodną o temperaturze 56 °C. Po całkowitym rozmrożeniu BRC przenieść go do łaźni wodnej i inkubować przez 30 minut.
- Po inkubacji usunąć inaktywowany termicznie BRC z łaźni wodnej i pozostawić do ostygnięcia w temperaturze pokojowej (RT) przez 10-15 minut. Energicznie wymieszać i podsycić ~150 μL do 1,5 ml probówek mikrowirówek. Porcje przechowywać w temperaturze ≤ -10 °C.
- Przygotuj zapas bakterii docelowych
UWAGA: Poniższa procedura jest stosowana do przygotowania 48 podwielokrotności docelowego zapasu bakterii; Jeśli potrzebnych jest więcej porcji, protokół można skalować w górę.
- Wyjąć fiolkę z preparatem Bacteria Master z zamrażarki i zeskrobać zamrożoną powierzchnię bakteryjną, aby usunąć niewielką ilość lodu z fiolki na płytkę z agarem z krwią. Natychmiast umieścić główną fiolkę z zapasem w zamrażarce.
- Rozłóż tę małą porcję bulionu bakteryjnego na płytkę z agarem z krwią i przykryj ją pokrywką z płytki. Inkubować płytkę do góry nogami przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 .
- Przenieś ~ 10 izolowanych gładkich kolonii do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 30 ml bulionu LB. Inkubować przez 3-5 godzin w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając, aż bulion hodowlany osiągnie OD600 ~0,6-0,7.
- Zbierz górne 12,5 ml kultury i przenieś do świeżej probówki o pojemności 50 ml. Odwirować kulturę przy 15 000 x g przez 2 minuty za pomocą mikrowirówki stołowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 25 ml 15% sterylnego glicerolu-LB.
- Dobrze wymieszaj i dozuj 0,5 ml porcji do sterylnych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml (~48 probówek). Porcje należy przechowywać w temperaturze ≤ -70 °C w zamrażarce.
- Przed użyciem potwierdzić tożsamość bakterii za pomocą testu aglutynacji.
- Określenie optymalnego współczynnika rozcieńczenia dla bakterii docelowych stock
UWAGA: Każda partia docelowych bakterii musi być miareczkowana w warunkach testowych w celu określenia rozcieńczenia niezbędnego do uzyskania ~120 CFU/plamkę na płytkach LB.
- Zaopatrzyć się w płytkę do mikromiareczkowania (płytkę rozcieńczającą) i dodać 135 μl buforu do testu do studzienki 1A. Dodać 120 μl masła do teczki 1B-1H.
- Wyjmij fiolkę z zamrożonymi bakteriami docelowymi z zamrażarki i rozmroź w temperaturze pokojowej. Dodaj 15ul rozmrożonego wywaru bakteryjnego do studzienki 1A, aby uzyskać 10-krotne rozcieńczenie bulionu bakteryjnego.
- Przenieść 30 μl roztworu bakteryjnego ze studzienki 1A do studzienki 1B, aby przeprowadzić 5-krotne seryjne rozcieńczenie. Kontynuować 5-krotne seryjne rozcieńczenia do dołka 1H, co daje w sumie 8 rozcieńczeń (1:10; 1:50; 1:250; 1:1 250; 1:6 250; 1: 31 250; 1: 156 250; 1:781 250).
- Weź kolejną płytkę do mikromiareczkowania (płytkę do oznaczania) i dodaj 20 μl buforu do oznaczania do wszystkich studzienek w kolumnach 1 i 2 na płytce testowej.
- Przenieść 10 μl rozcieńczonych bakterii z każdej studzienki w kolumnie 1 płytki rozcieńczającej do odpowiednich studzienek w kolumnach 1 i 2 płytki do oznaczania. 10 μl bakterii przenosi się z dołka 1A płytki rozcieńczającej do studzienki 1A i 2A na płytce do oznaczania itd.
- Kontynuuj test zgodnie z opisem w teście bakteriobójczym surowicy (SBA) poniżej dla kontroli A i kontroli B, kroki 3.6-3.12.
- Po inkubacji płytek na lodzie za pomocą pipety wielokanałowej z 8 końcówkami do pipet narysować 10 μl z dołków w kolumnie 1 na płytkę LBA. Zauważ również studzienki od kolumny 2 na płycie LBA.
- Kontynuuj test zgodnie z opisem poniżej w krokach 3.14-4.6.
- Określ rozcieńczenie bakterii, które daje ~ 120 CFU/plamkę w kontroli B, to rozcieńczenie zostanie użyte w teście.
2. Test bakteriobójczy surowicy (SBA)
UWAGA: Procedura opisana poniżej dotyczy jednej płytki testowej, ale liczba płytek testowych może zostać zwiększona.
- Próbki do badań inaktywowane termicznie przez inkubację próbek w łaźni wodnej o temperaturze 56 °C przez 30 min.
nuta: Badane próbki muszą być inaktywowane termicznie przed badaniem w celu zniesienia wszelkiej endogennej aktywności dopełniacza. Można to zrobić przed badaniem, a inaktywowane próbki można ponownie zamrozić lub przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu badania.
- Weź płytkę testową i dodaj 20 μl buforu do testu do kolumn od 1 do 12 w wierszach od A do G. Dodaj 20 μl buforu do testu do kolumn 1 i 2 wiersza H, patrz tabela 1.
- Załadować 30 μl każdej badanej próbki, w dwóch egzemplarzach, do rzędu H płytki do oznaczania. Na przykład dozować 30 μl próbki 1 do studzienek 3H i 4H, a 30 μl próbki 2 do studzienek 5H i 6H itd.
- Wykonać 3-krotne seryjne rozcieńczenia badanych próbek za pomocą pipety wielokanałowej.
- Usunąć 10 μ próbki z dołków 3H-12H i przenieść ją do odpowiednich studzienek w rzędzie G i wymieszać próbkę studzienkę, pipetując w górę i w dół 8-10 razy.
- Następnie usunąć 10 μ z dołków 3G-12G i przenieść do odpowiednich studzienek w rzędzie F i dobrze wymieszać.
- Kontynuować te seryjne rozcieńczenia przez rząd A. Po wymieszaniu studzienek w rzędzie A wyjąć i wyrzucić 10 μl z dołków 3A-12A, tak aby wszystkie studzienki zawierały 20 μl.
nuta: Ponieważ stosuje się 20 μl surowicy w całkowitej objętości testu wynoszącej 80 μl, w teście stosuje się 4-krotne dodatkowe rozcieńczenie. Rozcieńczenie to musi być uwzględnione przy obliczaniu miana SBA poprzez pomnożenie rozcieńczenia surowicy przez 4. Na przykład, jeżeli stosuje się początkowe rozcieńczenie 1:2, rzeczywiste badane rozcieńczenie wynosi 1:8.
- Wyjąć jedną fiolkę z zamrożonym bulionem z bakterii docelowych i rozmrozić w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć bakterie w 20 ml buforu testowego zgodnie z wcześniej ustalonym optymalnym współczynnikiem rozcieńczenia (ten współczynnik rozcieńczenia określono w sekcji 1.3). Dodać 10 μl rozcieńczonych bakterii do każdego dołka płytki testowej za pomocą pipety wielokanałowej.
- Wyjąć jedną fiolkę zamrożonego BRC i jedną fiolkę zamrożonego BRC inaktywowanego termicznie, rozmrozić w temperaturze pokojowej pod bieżącą zimną wodą lub umieścić na ruszcie szafy bezpieczeństwa biologicznego z nadmuchem powietrza w celu szybkiego rozmrożenia.
- Przygotować 20% roztwór inaktywowanego termicznie BRC. Zmieszać 100 μl inaktywowanego termicznie BRC z 400 μl buforu do oznaczania. Dodać 50 μl tego 20% inaktywowanego termicznie roztworu BRC do wszystkich studzienek w kolumnie 1 (studzienki kontrolne A).
nuta: Inaktywowany termicznie BRC jest stosowany jako kontrola do monitorowania niespecyficznego zabijania (NSK) w teście.
- Przygotuj 20% roztwór natywnego BRC. Wymieszaj 1 ml natywnego BRC z 4 ml buforu testowego. Dodać 50 μl tej mieszaniny do wszystkich studzienek w kolumnach od 2 do 12 (studzienki kontrolne B i studzienki na próbki testowe).
nuta: Końcowe stężenie BRC w mieszaninie reakcyjnej wynosi 12,5%.
- Krótko wymieszać płytkę testową, delikatnie potrząsając przez 10-15 s na wytrząsarce do płytek lub mieszając, pipetując 8 razy w górę i w dół za pomocą pipety wielokanałowej.
- Umieścić płytkę testową w inkubatorze mikrobiologicznym o temperaturze 37 °C na 2 godziny (bez wstrząsania).
- Wysuszyć 2 płytki LBA, zdejmując pokrywki i umieszczając płytki stroną zadrukowaną do góry w komorze bezpieczeństwa biologicznego na 40-60 minut.
- Po zakończeniu 2-godzinnej inkubacji przenieś płytkę testową na mokry lód i inkubuj przez 10-20 minut, aby zatrzymać reakcję.
- Za pomocą pipety 12-kanałowej wymieszać studzienki w rzędzie H i umieścić płytkę 10 μl mieszaniny reakcyjnej na dnie płytki LBA. Natychmiast przechyl płytkę i pozwól plamom przebiec przez ~1,5-2 cm. Powtórz tę procedurę dla rzędów G, F i E, dostrzegając je powyżej poprzedniego rzędu na tabliczce LBA. Rzędy E, F, G i H są zaznaczone na jednej tabliczce LBA, a rzędy A, B, C i D są zaznaczone na drugiej tabliczce LBA w ten sam sposób, patrz Rysunek 1.
- Inkubować płytki LBA w temperaturze pokojowej, aż roztwór zostanie zaadsorbowany na płytkach LBA (10-15 min). Umieść pokrywki na płytkach LBA i umieść płytki LBA w inkubatorze mikrobiologicznym do góry nogami, aby inkubować przez noc (~16-18 godzin). Inkubować Shigella flexneri 2a i 3a w temperaturze 29 °C, a inkubować S. sonnei w temperaturze 26 °C.
nuta: W tych temperaturach powstają mniejsze "mikrokolonie" o rozmiarach odpowiednich do dokładnego liczenia przez licznik kolonii9.
- Po całonocnej inkubacji dodać 25 ml agaru Overlay (w temperaturze ~55 °C) zawierającego 100 μg/ml TTC i 0,1% NaN3 do każdej płytki LBA.
- Inkubować płytki LBA w temperaturze 37 °C przez 2 godziny, aby bakterie, które przeżyły, mogły rozwinąć czerwone zabarwienie, patrz rysunek 1 poniżej.
- Sfotografuj płyty za pomocą aparatu cyfrowego i prześlij obrazy do komputera, na którym zainstalowano oprogramowanie NIST Integrated Colony Enumerating Software (NICE), patrz rysunek 2.
nuta: Oprogramowanie NICE do liczenia kolonii jest dostępne bezpłatnie. Zobacz Listę materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje i instrukcje instalacji.
Tabela 1: Układ płytki testowej. Kolumny 1 i 2 zawierają studzienki kontrolne dopełniacza. Kontrola A znajduje się w kolumnie 1 i jest kontrolną dopełniaczką inaktywowaną termicznie, zawierającą bufor SBA, bakterie i dopełniacz inaktywowany termicznie. Kontrola B znajduje się w kolumnie 2 i jest aktywną kontrolą dopełniacza, zawierającą bufor SBA, bakterie i dopełniacz. Kolumny 3-12 zawierają próbki surowicy. Każdą próbkę bada się w dwóch egzemplarzach i seryjnie rozcieńcza 3-krotnie od rzędu H do rzędu A
| 1 | cyfra arabska | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| ZA | Kontrola A | Kontrola B | Rozcieńczenie 8 | Rozcieńczenie 8 | Rozcieńczenie 8 | Rozcieńczenie 8 | Rozcieńczenie 8 | Rozcieńczenie 8 | Rozcieńczenie 8 | Rozcieńczenie 8 | Rozcieńczenie 8 | Rozcieńczenie 8 |
| W | Kontrola A | Kontrola B | Rozcieńczenie 7 | Rozcieńczenie 7 | Rozcieńczenie 7 | Rozcieńczenie 7 | Rozcieńczenie 7 | Rozcieńczenie 7 | Rozcieńczenie 7 | Rozcieńczenie 7 | Rozcieńczenie 7 | Rozcieńczenie 7 |
| Z | Kontrola A | Kontrola B | Rozcieńczenie 6 | Rozcieńczenie 6 | Rozcieńczenie 6 | Rozcieńczenie 6 | Rozcieńczenie 6 | Rozcieńczenie 6 | Rozcieńczenie 6 | Rozcieńczenie 6 | Rozcieńczenie 6 | Rozcieńczenie 6 |
| D | Kontrola A | Kontrola B | Rozcieńczenie 5 | Rozcieńczenie 5 | Rozcieńczenie 5 | Rozcieńczenie 5 | Rozcieńczenie 5 | Rozcieńczenie 5 | Rozcieńczenie 5 | Rozcieńczenie 5 | Rozcieńczenie 5 | Rozcieńczenie 5 |
| E | Kontrola A | Kontrola B | Rozcieńczenie 4 | Rozcieńczenie 4 | Rozcieńczenie 4 | Rozcieńczenie 4 | Rozcieńczenie 4 | Rozcieńczenie 4 | Rozcieńczenie 4 | Rozcieńczenie 4 | Rozcieńczenie 4 | Rozcieńczenie 4 |
| Z | Kontrola A | Kontrola B | Rozcieńczenie 3 | Rozcieńczenie 3 | Rozcieńczenie 3 | Rozcieńczenie 3 | Rozcieńczenie 3 | Rozcieńczenie 3 | Rozcieńczenie 3 | Rozcieńczenie 3 | Rozcieńczenie 3 | Rozcieńczenie 3 |
| Z | Kontrola A | Kontrola B | Rozcieńczenie 2 | Rozcieńczenie 2 | Rozcieńczenie 2 | Rozcieńczenie 2 | Rozcieńczenie 2 | Rozcieńczenie 2 | Rozcieńczenie 2 | Rozcieńczenie 2 | Rozcieńczenie 2 | Rozcieńczenie 2 |
| H | Kontrola A | Kontrola B | Rozcieńczenie 1 | Rozcieńczenie 1 | Rozcieńczenie 1 | Rozcieńczenie 1 | Rozcieńczenie 1 | Rozcieńczenie 1 | Rozcieńczenie 1 | Rozcieńczenie 1 | Rozcieńczenie 1 | Rozcieńczenie 1 |
| | | Próbka 1 | Próbka 2 | Próbka 3 | Próbka 4 | Próbka 5 |
