$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie apoptotycznych tymocytów znakowanych CFSE
- Poddaj eutanazji dwie naiwne myszy C57 / B6 przez wdychanie CO2 przez 10 minut i przeprowadź sekcję w celu otwarcia jamy klatki piersiowej, usuń (wyciągnij) grasicę za pomocą zakrzywionych kleszczy z cienką końcówką na szalkę Petriego do hodowli tkankowej zawierającej 10 ml pożywki RPMI1640.
- Zawiesinę jednokomórkową należy uzyskać, mieląc całą grasicę na dwóch matowych końcach szkiełek mikroskopowych, a następnie przefiltrować zawiesinę przez sitko do komórek o wielkości 100 μm.
- Zebrać 10 ml zawiesiny grasicy do probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy sile 300 x g przez 5 minut.
- Usunąć supernatant, ponownie zawiesić w 40 ml 1x PBS i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
- Wirować przy 300 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
- Zawiesić w 20 ml 1x PBS w probówce 50 ml jako zawiesinę jednokomórkową z maksymalnie 2 x 108 komórek (jeśli więcej niż 2 x 108 komórek, ponownie zawieś resztę komórek w innych 20 ml 1 x PBS w innej probówce 50 ml).
- Przygotować 5 μM CFSE w równej objętości (20 ml) 1x PBS w oddzielnej probówce o pojemności 50 ml, pipetując 40 μl roztworu podstawowego CFSE (2,5 mM) do 20 ml 1x PBS i dobrze wymieszać, odwracając probówkę 2 - 3 razy.
- Dodaj 20 ml CFSE z kroku 1.7 do 20 ml zawiesiny komórek z kroku 1.6 (końcowe stężenie CFSE wynosi teraz 2,5 μM).
nuta: Na każde 20 ml zawiesiny komórek potrzebna jest probówka CFSE o pojemności 20 ml.
- Odwrócić komórkę i probówkę z mieszaniną CFSE 2-3 razy i inkubować mieszaninę w ciemności w temperaturze pokojowej przez maksymalnie 2 minuty, a następnie zatrzymać reakcję przez dodanie 10 ml inaktywowanej termicznie surowicy końskiej.
- Odwirować mieszaninę probówek o pojemności 50 ml przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
nuta: Jeśli oznakowanie CFSE powiedzie się, granulka komórki zmieni kolor na jasnożółty.
- Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 40 ml 1x PBS i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
- Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
- Ponownie przemyć osad komórkowy 40 ml RPMI1640 podłoża.
- Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą pożywki do hodowli tkankowej RPMI1640 (RPMI1640, 20 mM HEPES, 10% FBS (inaktywowany termicznie), 20 mM glutaminy i 1x Pen/Strep) w stężeniu 7 x 106 komórek/ml w naczyniu do hodowli tkankowych o średnicy 100 mm.
nuta: W przypadku uzyskania większej liczby komórek potrzebne będzie oddzielne naczynie do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm.
- Dodać staurosporynę do hodowli zawiesiny komórkowej o końcowym stężeniu 1 μM i hodować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych zasilanym 5% CO2 .
2. Przygotowanie makrofagów otrzewnowych
- Wstrzyknąć dwóm myszom C57B6 (lub dowolnym myszom manipulowanym genami w laboratorium) dootrzewnowo 1 ml 3% dojrzałego tioglikolanu w dniu 0.
- Poddaj myszy eutanazji w 5 dniu, jak w kroku 1.1, odetnij i obierz skórę brzucha, ale pozostaw nienaruszoną otrzewną. Przepłukać jamę otrzewnej, szybko wtłaczając 10 ml buforu do przemywania (RPMI1640, 2% FBS, 0,04% EDTA) do jamy otrzewnej za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml dołączonej do igły 18 G.
- Powoli pobrać bufor do przemywania za pomocą tej samej igły/strzykawki i zebrać bufor do przemywania do probówki o pojemności 50 ml.
- Przemyć zgłębnik otrzewnowy dwukrotnie 1x PBS, ponownie zawiesić makrofagi otrzewnej w RPMI1640 pożywce do hodowli tkankowej o gęstości 2 x 106 komórek/ml i podwielokrotności 500 μl do każdego dołka płytki 24-dołkowej. Pozostawić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych na 2 godziny.
- Usunąć pływające komórki, dwukrotnie odsysając je i zastępując 500 μl świeżej pożywki hodowlanej.
- Opcjonalnie dodać inhibitor tyrozyny receptora TAM, RXDX-106, w stężeniach wskazanych na rysunku do każdej studzienki kultury makrofagów i inkubować przez kolejne 2 godziny.
3. Współhodowla makrofagów otrzewnowych z apoptotycznym tymocytami
- Zbierz apoptotyczne tymocyty z kroku 1 i przemyj trzy razy RPMI1640 pożywką. Skuteczność indukcji apoptotycznej można zmierzyć na tym etapie za pomocą zestawu Annexin V/7-AAD.
- Rozmieść 0 - 12 x 106 komórek (w pożywce 500 μl) do każdej studzienki kultur makrofagów z protokołu #2, zgodnie z układem eksperymentalnym (np. patrz rysunek 1). To sprawia, że cała objętość kultury wynosi 1 ml w każdym dołku 24-dołkowej płytki. Dodaj przeciwciało blokujące do kultury bezpośrednio przed dodaniem apoptotycznych tymocytów.
- Hodować mieszaninę komórek w temperaturze 37 °C przez 4 godziny w inkubatorze do hodowli tkankowych zasilanym 5%CO2
.
- Przemyć każdą studzienkę hodowli 1x PBS (zawierającym 500 μM EDTA) dwukrotnie, aby usunąć swobodnie pływające komórki apoptotyczne.
- Na tym etapie wybarwić makrofagi związane z płytką CD11b-PE.
- Umyj makrofagi związane z płytką buforem barwiącym (1x PBS, 1% BSA).
- Do każdej studzienki dodać 200 μl buforu barwiącego zawierającego 2 μl CD11b-PE.
- Inkubować płytkę w temperaturze 4 °C przez 20 minut.
- Umyj każdą studzienkę płytki trzykrotnie buforem barwiącym.
- Dodać 200 μl buforu barwiącego i przystąpić do analizy obrazu pod mikroskopem fluorescencyjnym.
