$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Polaryzacja HMDM
- W sterylnych warunkach przygotować pożywkę gruntującą M1, dodając γ interferonu (IFNγ; 20 ng/ml) i lipopolisacharyd (LPS; 1 μg/ml) do kompletnej pożywki hodowlanej RPMI-1640. Przygotować pożywkę kondycyjną M2, dodając interleukinę 4 (IL-4; 20 ng/ml) do kompletnej pożywki hodowlanej RPMI-1640.
- W sterylnych warunkach należy odsysać pożywki z dołków na płytki do hodowli tkankowych, które zawierają makrofagi pochodzące z ludzkich monocytów, HMDM, które zostały wysiane i wyhodowane zgodnie z opisem w sekcji 1.
- Ostrożnie umyć studzienki zawierające komórki 3x sterylnym PBS (wstępnie podgrzanym do 37 °C), używając 1 ml porcji PBS.
- Dodać 1 ml pożywki gruntującej M1 lub M2 do każdej studzienki zawierającej HMDM (w zależności od tego, która z nich jest odpowiednia dla eksperymentu).
- Inkubować komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 w inkubatorze komórkowym.
2. Stymulacja HMDM w celu wywołania uwolnienia MET
- W sterylnych warunkach należy przygotować pożywkę hodowlaną zawierającą różne stymulatory pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów o uwalnianiu MET (w zależności od tego, który z nich jest odpowiedni dla eksperymentu) do kompletnych pożywek RPMI-1640: PMA (25 nM), ludzkiego rekombinowanego TNFα (25 ng / ml) lub ludzkiego rekombinowanego IL-8 (50 ng / ml).
- Do eksperymentów z kwasem podchlorawym, stymulacją HOCl, należy przygotować HOCl (200 μM) w HBSS (wstępnie podgrzanym do 37 °C), bezpośrednio przed dodaniem do komórek. Upewnij się, że HOCl nie jest przygotowany w kompletnym nośniku komórkowym.
nuta: Stężenie roztworu podstawowego HOCl określa się ilościowo, mierząc absorbancję UV roztworu przy 292 nm i pH =11,6 oraz stosując współczynnik ekstynkcji 350 M-1 cm-1.
- Po poddaniu działaniu polaryzacji opisanej w sekcji 2, należy odessać pożywkę komórkową z każdej studzienki i ostrożnie przemyć komórki 3x podwielokrotnościami po 1 ml jałowego PBS (dla PMA, TNFα i IL-8) lub HBSS (dla HOCl), które zostały wstępnie podgrzane do 37 °C.
- W przypadku eksperymentów z PMA, TNFα lub IL-8: dodać 1 ml kompletnej pożywki zawierającej PMA, TNFα lub IL-8 po usunięciu PBS w końcowym etapie mycia.
- W przypadku doświadczeń z TNFα inkubować komórki przez 6 godzin w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 w inkubatorze komórkowym. W przypadku doświadczeń z PMA i IL-8 inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 w inkubatorze komórkowym.
- W przypadku eksperymentów z HOCl dodaj 1 ml HOCl do HBSS po usunięciu HBSS w końcowym etapie mycia. Następnie inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 w inkubatorze komórkowym.
- Ostrożnie odessać supernatant komórek i przemyć komórki 3x 1 ml porcjami HBSS, jak opisano w kroku 2.3.
- Po wyjęciu HBSS z ostatniego etapu mycia, dodaj 1 ml kompletnej pożywki hodowlanej RPMI-1640. Następnie inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 w inkubatorze komórkowym.
3. Wizualizacja MET w żywej hodowli komórkowej
- Przygotować zielony barwnik SYTOX w HBSS o stężeniu 40 μM.
- Pod koniec zabiegów opisanych w sekcji 2 w celu wywołania uwalniania MET, należy bezpośrednio dodać 25 μl z 40 μM barwnika do każdej studzienki zawierającej HMDM.
- Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut w ciemności.
- Umieścić HMDM w studzienkach do hodowli tkankowych na stoliku mikroskopu odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego do obrazowania.
- Zabiegi mikroskopowe
- Włącz fluorescencyjne źródło światła o szerokim spektrum działania, źródło światła jasnego pola i mikroskop odwrócony zainstalowany z kolorową kamerą cyfrową o wysokiej rozdzielczości (patrz Tabela materiałów).
- Obrócić koło filtra do pozycji "numer 2" dla zielonej fluorescencji (wzbudzenie = 504 nm, emisja = 523 nm) do obrazowania próbek barwionych na zielono zawartych w studzienkach do hodowli tkankowych.
- Korzystając z obiektywu 5x, ustaw ostrość obrazu za pomocą zgrubnej ostrości, a następnie pokręteł precyzyjnego ustawiania ostrości na mikroskopie, aż obraz będzie ostry, wyraźny i ostry, gdy będzie oglądany przez okular mikroskopu.
- Przełącz mikroskop w tryb aparatu.
- Uruchom skojarzone oprogramowanie.
- Wybierz kartę Przechwytywanie w oprogramowaniu.
- Kliknij przycisk Odtwórz, aby wyświetlić podgląd obrazu i wyreguluj pokrętło precyzyjnej ostrości na mikroskopie, aż obraz będzie ostry, wyraźny i ostry w oknie podglądu oprogramowania.
- Kliknij przycisk Przechwyć.
nuta: Przechwycony obraz zostanie automatycznie wyświetlony w dołączonym oprogramowaniu.
- W oprogramowaniu kliknij Plik | Zapisz jako wymagany typ pliku obrazu.
- W mikroskopie obróć koło filtra do pozycji "numer 5" do obrazowania w jasnym polu i powtórz kroki 3.5.2–3.5.9, aby uzyskać odpowiedni obraz w jasnym polu.
- Powtórz kroki 3.5.2–3.5.10 w razie potrzeby w celu późniejszego uzyskania obrazu.