Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Oczyszczanie ludzkich leukocytów wielojądrzastych i izolacja ludzkiej surowicy
UWAGA: Wszystkie odczynniki powinny być rutynowo sprawdzane pod kątem obecności endotoksyn za pomocą dostępnego na rynku zestawu do wykrywania endotoksyn i powinny zawierać <25,0 pg/ml endotoksyny, aby zapobiec niepożądanemu zalewaniu PMN.
- Przynieś 50 ml 3% dekstranu-0,9% NaCl (w/v), 35 ml 0,9% NaCl (w/v), 20 ml 1,8% NaCl (w/v), 12 ml 1,077 g/ml roztworu gradientu gęstości i 20 ml wody do wstrzykiwań lub nawadniania do temperatury pokojowej.
- Aby wyizolować surowicę ludzką, należy inkubować 4 ml świeżo pobranej krwi ludzkiej bez antykoagulantu w temperaturze 37 °C w szklanej probówce o pojemności 15 ml przez 30 minut. Po inkubacji odwirować próbkę o masie 2 000–3 000 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś górną warstwę surowicy do świeżej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i umieść ją na lodzie.
- Połączyć 25 ml świeżo pobranej heparynizowanej (1000 jednostek/ml) pełnej krwi ludzkiej z 25 ml 3% dekstronu-0,9% NaCl o temperaturze pokojowej (stosunek 1:1) w dwóch powtórzonych stożkowych probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml (całkowita objętość 50 ml na probówkę). Wymieszaj, delikatnie kołysząc każdą stożkową probówkę o pojemności 50 ml, a następnie odstaw w temperaturze pokojowej na 30 minut.
- Po inkubacji w temperaturze pokojowej pojawią się dwie oddzielne warstwy. Przenieść wierzchnią warstwę każdej mieszaniny dekstranu i krwi do nowych stożkowych probówek o pojemności 50 ml i wirować przy 450 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej z niskimi hamulcami lub bez hamulców.
- Ostrożnie odessać oba supernatanty i wyrzucić je bez naruszania osadów komórkowych. Delikatnie ponownie zawiesić każdą komórkę w 2 ml 0,9% NaCl o temperaturze pokojowej, połączyć zawieszone granulki w jednej stożkowej probówce o pojemności 50 ml, a następnie dodać pozostałe 0,9% NaCl (końcowa objętość 35 ml).
- Ostrożnie umieścić 10 ml roztworu gradientu gęstości o temperaturze pokojowej 1,077 g/ml pod zawiesiną komórek za pomocą pipety ręcznej. Wirować z prędkością 450 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej z niskimi hamulcami lub bez hamulców. Delikatnie zassać supernatant, nie naruszając osadu komórkowego. Supernatant będzie zawierał jednojądrzaste komórki krwi obwodowej, które można pobrać w sposób opisany wcześniej.
- Liza czerwonych krwinek poprzez ponowne zawieszenie osadu komórkowego w 20 ml wody o temperaturze pokojowej. Delikatnie wymieszaj, kołysząc tubką przez 30 sekund. Lizie czerwonych krwinek będzie towarzyszyć wyraźne zmniejszenie zmętnienia.
- Natychmiast dodać 20 ml 1,8% NaCl (w temperaturze pokojowej [RT]) i odwirować próbkę o sile 450 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
nuta: Ważne jest, aby zminimalizować czas, w którym PMN pozostają w samej wodzie po lizie czerwonych krwinek, aby zmaksymalizować wydajność PMN i zapobiec lizie i/lub aktywacji PMN.
- Ostrożnie odessać supernatant, nie naruszając osadu komórkowego. Delikatnie zawiesić osad komórkowy w 2 ml pożywki RT RPMI 1640 i umieścić ją na lodzie.
- Policz komórki za pomocą hemocytometru. Ponownie zawiesić oczyszczone PMN w stężeniu 1 x 107 komórek/ml za pomocą lodowatego RPMI i przechowywać je na lodzie.
- Połączyć 100 μl oczyszczonych PMN (1 x 106 komórek) z 300 μl lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco (DPBS) zawierającej 1 μl barwnika jodkiem propidyny w dwóch probówkach do cytometrii przepływowej. W celu uzyskania pozytywnej kontroli uszkodzenia błony plazmatycznej należy dodać 40 μl 0,5% roztworu Triton X-100 do jednej z probówek cytometrii przepływowej i dokładnie wymieszać.
- Użyj cytometrii przepływowej, aby zmierzyć rozproszenie do przodu, rozproszenie boczne i barwienie jodkiem propidyny (maksima wzbudzenia/emisji przy 535/617 nm) oczyszczonych komórek (ryc. 1).
nuta: Analiza rozproszenia do przodu i z boku pozwoli zidentyfikować niepożądane populacje limfocytów i monocytów. Jodek propidyny barwi tylko komórki z naruszoną błoną plazmatyczną i nie należy stosować oczyszczonych PMN, które mają wyraźne populacje komórek dodatnich w postaci jodku propidianu. W tych badaniach oczyszczone PMN stosowano tylko wtedy, gdy zawierały >98% oczyszczonych komórek i <5% barwionych na obecność jodku propidyny.
- Przygotować 96-dołkową płytkę do oznaczania cytotoksyczności PMN, pokrywając poszczególne studzienki, które zostaną użyte w tym teście, 100 μl 20% izolowanej ludzkiej surowicy, która została rozcieńczona DPBS.
nuta: Posiewanie PMN bezpośrednio na plastiku lub szkle spowoduje aktywację komórek. Należy pamiętać o dołączeniu co najmniej jednej studzienki kontroli ujemnej, która będzie otrzymywać tylko pożywkę, oraz co najmniej jednej studzienki kontroli pozytywnej, która otrzyma 0,05% Triton X-100.
- Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Po inkubacji należy dwukrotnie przemyć pokryte studzienki lodowatym DPBS, aby usunąć nadmiar surowicy. Delikatnie postukaj w płytkę do góry nogami, aby usunąć resztki DPBS i umieść ją na lodzie.
- Delikatnie dodać 100 μl oczyszczonych ludzkich PMN o stężeniu 1 x 107 komórek/ml do każdej powlekanej studzienki (1 x 106 PMN/studzienkę). Pozwól PMN osiąść w studzienkach, inkubując płytkę na lodzie przez co najmniej 5 minut. Utrzymuj płytkę poziomo, aby umożliwić równomierne rozmieszczenie komórek w każdej studzience i pozostaw ją na lodzie, aby uniknąć niepożądanej aktywacji PMN.
2. Test cytotoksyczności białek zewnątrzkomórkowych S. aureus przeciwko ludzkim leukocytom wielojądrzastym
- Hodowlę S. aureus przez noc w tryptycznym bulionie sojowym (TSB) w inkubatorze z wytrząsaniem ustawionym na temperaturę 37 °C. W tych badaniach 20 ml TSB w oddzielnych 150 ml kolbach Erlenmeyera zaszczepiono zamrożonymi kulturami szczepów S. aureus USA300 lub USA300ΔsaeR/S i hodowano przez około 14 godzin z wytrząsaniem przy 250 obr./min.
- Subkultura S. aureus, wykonując rozcieńczenie 1:100 nocnej kultury bakteryjnej ze świeżą pożywką. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem, aż bakterie osiągną wczesną fazę wzrostu stacjonarnego.
nuta: W tych eksperymentach 20 ml tryptycznego bulionu sojowego w 150 ml kolbach Erlenmeyera zaszczepiono 200 μl nocnego roztworu USA300 lub USA300ΔsaeR/S i inkubowano w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min przez 5 godzin.
- Gdy bakterie osiągną wczesną fazę wzrostu stacjonarnego, przenieś 1 ml subkulturowanego S. aureus do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i odwiruj przy 5 000 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Po odwirowaniu przenieść supernatant do strzykawki o pojemności 3 ml. Przepuść supernatanty przez filtr 0,22 μm i do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml na lodzie.
- Przeprowadzić seryjne rozcieńczenia supernatantów lodowatymi pożywkami używanymi do hodowli S. aureus.
nuta: W pokazanych eksperymentach supernatanty z USA300 i USA300ΔsaeR/S poddano czterem kolejnym rozcieńczeniom 1/2 log lodowatym TSB.
- Delikatnie dodać próbki sklarowanego osadu lub same pożywki (do kontroli ujemnych i dodatnich) do indywidualnych studzienek 96-dołkowych płytek zawierających PMN na lodzie z kroku 1.15. W tych eksperymentach do każdej studzienki dodano 10 μl próbek supernatantu USA300 lub USA300ΔsaeR/S. Delikatnie kołysać płytkę, aby rozprowadzić supernatanty w studzienkach i inkubować w temperaturze 37 °C.
- W pożądanym czasie wyjmij płytkę z inkubatora i umieść ją na lodzie. Dodać 40 μl 0,5% Triton X-100 do studzienki kontroli dodatniej.
- Delikatnie odpipetować próbki w górę i w dół w każdym dołku, aby całkowicie usunąć wszystkie PMN przylegające do płytki, a następnie przenieść próbki do probówek do cytometrii przepływowej na lodzie, które zawierają 300 μl lodowatego DPBS z 1 μl jodku propidyny.
- Zmierzyć proporcję PMN dodatnich w jodku propidyny za pomocą cytometrii przepływowej (ryc. 2A). Po związaniu z DNA jodek propidyny ulega wzbudzeniu/emisji przy długości fali 535/617 nm.
