Test cytotoksyczności szczepów Staphylococcus aureus na neutrofilach po fagocytozie

Streszczenie

Źródło: Dankoff, J. G. et al., Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes. J. Vis. Exp. (2020)

W tym filmie demonstrujemy test do wykrywania cytotoksyczności zjadliwych i mniej zjadliwych szczepów Staphylococcus aureus przeciwko ludzkim neutrofilom po fagocytozie za pomocą cytometrii przepływowej.

Protokół

1. Test cytotoksyczności S. aureus przeciwko ludzkim leukocytom wielojądrzastym po fagocytozie

UWAGA: Krzywe wzrostu zdefiniowane przez gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) i stężenie bakterii muszą być wyznaczone empirycznie dla szczepów S. aureus, które mają być testowane przed rozpoczęciem tego testu. Powodzenie tych eksperymentów wymaga konsekwentnego zbierania równych stężeń każdego szczepu S. aureus testowanego w środkowej fazie wzrostu wykładniczego przy użyciu OD600 subkulturowanych bakterii.

1. Rozpocznij nocne hodowle szczepów S. aureus i subkultur bakterii, jak opisano poniżej.
   1. Hodowlę S. aureus przez noc w tryptycznym bulionie sojowym (TSB) w inkubatorze z wytrząsaniem ustawionym na temperaturę 37 °C. W tych badaniach 20 ml TSB w oddzielnych 150 ml kolbach Erlenmeyera zaszczepiono zamrożonymi kulturami szczepów S. aureus USA300 lub USA300ΔsaeR/S i hodowano przez około 14 godzin z wytrząsaniem przy 250 obr./min.
   2. Subkultura S. aureus, wykonując rozcieńczenie 1:100 nocnej kultury bakteryjnej ze świeżą pożywką. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.
2. Zbierz subkulturowany S. aureus, gdy osiągnie średni wykładniczy wzrost, przenosząc 1 ml hodowanych bakterii do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i odwirowując przy 5 000 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   nuta: W naszych warunkach wzrostu USA300 i USA300ΔsaeR/S osiągnęły średnią fazę wzrostu wykładniczego po około 135 minutach inkubacji.
3. Przemyć S. aureus po odwirowaniu przez zasysanie supernatantu, ponowne zawieszenie granulowanych bakterii w 1 ml DPBS, wirowanie próbki przez 30 s i odwirowanie przy 5 000 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
4. Opsonizować S. aureus przez ponowne zawieszenie osadu bakteryjnego w 1 ml 20% ludzkiej surowicy rozcieńczonej DPBS i inkubację w temperaturze 37 °C z mieszaniem przez 15 min.
5. Odwirować opsonizowane bakterie w dawce 5 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć S. aureus po odwirowaniu przez zasysanie supernatantu, ponowne zawieszenie granulowanych bakterii w 1 ml DPBS, a następnie wirowanie próbki, aż do całkowitego rozpadu osadu bakteryjnego plus dodatkowe 30 sekund. Odwirować bakterie w ilości 5 000 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
6. Ponownie zawiesić opsonizowane szczepy S. aureus w 1 ml RPMI, wirować próbkę, aż osad bakteryjny zostanie całkowicie rozbity, a następnie przez dodatkowe 30 s. Umieść bakterie na lodzie.
7. Rozcieńczyć opsonizowane szczepy S. aureus do pożądanego stężenia za pomocą lodowatego RPMI. Wiruj przez 30 s i umieść na lodzie.
8. Potwierdź stężenie opsonizowanego S. aureus przez posiew 1:10 seryjnych rozcieńczeń bakterii na tryptycznym agarze sojowym.
   nuta: Ponieważ różnice w stężeniu bakterii użytych w tym teście mogą mieć duży wpływ na późniejszą przepuszczalność błony plazmatycznej PMN (ryc. 1A), ważne jest, aby stężenie każdego badanego szczepu było określane dla każdego eksperymentu i było równoważne między szczepami.
9. Delikatnie dodać 100 μl/studzienkę każdego szczepu S. aureus lub RPMI (dla kontroli dodatniej i ujemnej) do PMN w 96-dołkowej płytce na lodzie. Delikatnie kołysz płytę, aby rozprowadzić S. aureus w studzienkach.
10. Zsynchronizować fagocytozę przez odwirowanie płytki w temperaturze 500 × g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C natychmiast po odwirowaniu (T = 0).
11. W pożądanym czasie wyjmij płytkę z inkubatora i umieść ją na lodzie. Dodać 40 μl 0,5% Triton X-100 do studzienki kontroli dodatniej.
12. Delikatnie pipetować próbki w górę i w dół w każdym dołku, aby całkowicie usunąć wszystkie PMN przyklejone do płytki, a następnie przenieść próbki do probówek cytometrii przepływowej na lodzie zawierającym 200 μl lodowatego DPBS z 1 μl jodku propidyny.
13. Analizować próbki pod kątem barwienia jodkiem propidyny za pomocą cytometrii przepływowej.
14. Zmierzyć proporcję PMN dodatnich w jodku propidyny za pomocą cytometrii przepływowej. Po związaniu z DNA jodek propidyny ulega wzbudzeniu/emisji przy długości fali 535/617 nm.

Wyniki

Rycina 1: Analiza cytometrii przepływowej PMN po fagocytozie S. aureus. (A) Proporcja PMN dodatnich w jodku propidyny 90 minut po fagocytozie o różnych stężeniach USA300 lub USA300∆saeR/S. (B) Stężenie opsonizowanych szczepów S. aureus użytych do eksperymentów przedstawiono w panelu A. Dane przedstawiono jako średnią SEM ± 4 oddzielnych eksperymentów z * p ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikroprobówki wirówkowe 1,5 ml z zatrzaskami	Firma VWR	89000-044	Stosowany w komórkach myjących
Probówki hodowlane 12x75mm	Firma VWR	Nr kat. 60818-430	Używany jako probówki do cytometrii przepływowej
Stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml	Firma VWR	Numer katalogowy: 89039-656	Do dozowania mediów
Bacto Tryptic Buwas sojowy, pożywka sojowo-kazeinowa	FischerNaukowy	211823	Do hodowli kultur komórkowych
Hemocytometr jasnej linii	Sigma-Aldrich	Z359629	Aparatura do liczenia komórek
DPBS, 1x (sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco) z wapniem i magnezem	Corning	21-030-CV	Stosowany w komórkach myjących
Ficoll-Paque PLUS	GE Opieka zdrowotna	17-1440-02	Oczyszczanie PMN
Fisherbrand Sterylne jednorazowe pipety serologiczne z polistyrenu	FischerNaukowy	13-678-11E	Do zasysania cieczy
Greiner CELLSTAR 96-dołkowe płytki	Millipore Sigma	Zobacz materiał M0687	Płytka do przechowywania próbek doświadczalnych
Filtry strzykawkowe OMICRON	Omicron Naukowy	SFPV13R	Do filtrowania supernatantów
Jodek propidyny	ThermoFisher Naukowy	Zobacz materiał P3566	Barwienie DNA nieprzepuszczalne dla błony
Kolby Erlenmeyera marki PYREX 4980	Cole'a-Parmera	EW-34503-24	Do hodowli kultur komórkowych
RPMI 1640, 1X bez L-glutaminy, czerwień fenolowa	Corning	17-105-CV	Stosowany w ogniwach ponownego zawieszania
Tryton X-100	Sigma-Aldrich	Silnik X100	Kontrola pozytywna integralności membrany

TGL powiedział: