Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Szczepy i warunki hodowli
Uwaga: szczep M. tuberculosis CDC1551 jest używany w tym badaniu, ale każdy szczep M. tuberculosis może być użyty w ten sam sposób.
- Hoduj bakterie w pożywce M-OADC-TW (bulion 7H9 uzupełniony 0,5% glicerolu, 10% kompleksem dekstrozy kwasu oleinowego bez katalazy i 0,05% Tween-80) w temperaturze 37 °C do OD600 0,5 (~ 0,2 x 107 jednostka tworząca kolonie lub CFU).
- Rozcieńczyć kulturę w M-OADC-TW (seria rozcieńczeń bakterii w stosunku 1:10). Rozcieńczone roztwory bakterii (105, 106, 107, 108) należy roztoczyć trzykrotnie na selektywnych płytkach 7H11, aby umożliwić oznaczenie CFU.
- Inkubować płytki przez cztery tygodnie w temperaturze 37 °C lub do momentu, gdy będzie można dokładnie policzyć kolonie.
- Odwirować inokulum bakteryjne przy sile 8,534 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad. Umyj granulkę raz 10 ml soli fizjologicznej (0,9% NaCl) i ponownie zawiesić osad w 15 ml soli fizjologicznej (0,9% NaCl).
2. Zakażenie aerozolem myszy za pomocą komory Madison
- Pozwól myszom zaaklimatyzować się w nowym otoczeniu przez tydzień.
- Zważ myszy przed załadowaniem ich do komory.
- Podłącz trzy przewody do listwy zasilającej: zasilanie komory głównej, pompę próżniową i sprężarkę powietrza, w tej kolejności.
- Ostrożnie odkręć szklany słoik. Przynieś szklany słoik do szafki bezpieczeństwa biologicznego i dodaj inokulum prowokacyjne zawieszone w 15 ml soli fizjologicznej (0,9% NaCl), aby uzyskać ~ 104 - 106 CFU bakterii w płucach.
- Zamknij pokrywkę szklanego słoika w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przymocuj słoik do nebulizatora i wyreguluj pionową rurkę ze stali nierdzewnej tak, aby dolny koniec (wlotowy) znajdował się około ćwierć cala poniżej poziomu płynu w słoiku.
- Załaduj wszystkie zwierzęta potrzebne do eksperymentu (komora może pomieścić do 90 myszy) do komory i zamknij wszystkie zatrzaski na drzwiach.
- Sprawdź główny (pokojowy) przepływomierz powietrza. Upewnij się, że środek pływaka (kuli) porusza się z prędkością około 50 l/min, jak zmierzono na skali po lewej stronie.
- Naciśnij przycisk Start na panelu sterowania komory. Ustaw natężenie przepływu powietrza przez przepływomierz powietrza sprężarki (mniejszy miernik po lewej stronie) na 4 l/min na skali. Sprawdź wzrokowo, aby upewnić się, że inokulum prowokacyjne jest poddawane nebulizacji.
- Po 15 minutach, gdy z przodu panelu sterowania pojawi się czerwona lampka, a sygnał dźwiękowy wskaże koniec biegu, naciśnij przycisk Reset w prawym dolnym rogu panelu sterowania, aby zresetować timery.
- Przytrzymaj mały czerwony przycisk na drzwiach komory, aby zwolnić podciśnienie.
- Otwórz drzwi komory i wyjmij zwierzęta. Umieść myszy z powrotem w klatkach.
- Wyjmij szklany słoik nebulizatora i umieść go w szczelnym, szczelnym pojemniku transportowym. Umieść pojemnik w komorze bezpieczeństwa biologicznego i wyrzuć zawiesinę prowokacyjną do wyznaczonego pojemnika na odpady.
- Umieść zużyty słoik nebulizatora w torbie na wypadek zagrożenia biologicznego i zamknij worek na czas transportu do autoklawu.
- Pod koniec procedury infekcji spryskaj wnętrze komory buforowanym fenolem i 70% etanolem i pozostaw komorę na 10 minut.
- Następnie bardzo dokładnie wytrzyj wszystkie dostępne powierzchnie wewnętrzne. Wyrzuć wszystkie zanieczyszczone ręczniki papierowe itp. w koszu na zagrożenia biologiczne. Autoklaw śmieci, pojemniki na odpady i zużyte słoiki nebulizatora.
- Umieść zwierzęta z powrotem w pomieszczeniu przechowawczym do momentu obrazowania.
- W dniu obrazowania należy przenieść zwierzęta w pojemniku wtórnym do pomieszczenia do obrazowania.
3. Znieczulenie zwierząt
- Znieczulij myszy izofluranem za pomocą dostosowanego systemu znieczulenia gazowego.
- Zważ każdy z dwóch kanistrów z filtrem węglowym znajdujących się na górze jednostki anestezjologicznej.
- Wymień na nowy kanister, jeśli jego waga jest o 50 g wyższa od masy początkowej.
- Sprawdź parownik, aby upewnić się, że izofluran jest wystarczający do zabiegu.
- Umieść uchwyt stożka nosowego w komorze obrazowania. Umieść liczbę stożków nosowych wymaganą do zabiegu i uszczelnij pozostałe otwory za pomocą blokerów stożka nosowego.
- Włącz dopływ tlenu z butli wysokociśnieniowej i ustaw go na 55 psi.
- Włącz pompę ewakuacyjną znajdującą się przed jednostką anestezjologiczną i ustaw ją na 8 l/min.
- Włącz przełącznik tlenu znajdujący się przed unitem anestezjologicznym.
- Włączyć dopływ gazu do komory indukcyjnej znieczulenia, aby ustawić przepływ gazu na 1,5 l/min. Wyłączyć dopływ gazu.
- Włącz dopływ gazu do komory obrazowania, aby ustawić przepływ gazu na 0,25 l/min. Wyłącz przepływ gazu.
- Włącz waporyzator izofluranu i ustaw go na 2 - 2,5%. Dostosuj poziom izofluranu do liczby i wagi zwierząt wykorzystywanych w eksperymencie, obracając pokrętło na parowniku izofluranu (2 - 2,5% dla myszy o wadze ~20 g; 4% dla świnki morskiej o wadze 300 g).
- Umieść myszy w komorze anestezjologicznej i zamknij pokrywę. Włączyć dopływ gazu do komory indukcyjnej znieczulenia.
- Pozostaw myszy w komorze indukcyjnej znieczulenia na 5 - 10 minut, aż do całkowitego znieczulenia.
- Po znieczuleniu myszy nałóż maść optyczną na oczy, aby chronić je podczas obrazowania.
- Umieść myszy w pozycji brzusznej lub mostkowej tak, aby ich nosy były umieszczone w stożku nosowym, aby ułatwić znieczulenie myszy podczas procedury obrazowania.
4. Obrazowanie fluorescencji enzymu reporterowego (REF)
- Wstrzyknąć substrat (20 μM, 2,5 μl/g wagi) przez wstrzyknięcie dootrzewnowe zarówno zakażonym, jak i kontrolnym myszom. Myszy są pod narkozą w komorze obrazowania przez mniej niż 1 minutę.
- Uruchom system obrazowania.
- Zainicjuj system, klikając przycisk Inicjuj. Poczekaj, aż pasek temperatury zmieni kolor na zielony.
nuta: Komora obrazowania składa się z podgrzewanej platformy, która utrzymuje temperaturę ciała zwierzęcia podczas obrazowania.
- Aby ustawić akwizycję obrazu, wybierz Fluorescencyjny | Trans-iluminacja dla całego zwierzęcia lub Epi-iluminacja dla tkanek płucnych, struktura i nakładka w Panelu sterowania akwizycją.
- Ustaw pole widzenia na B dla pojedynczej myszy, a poziom lampy na wysoki.
- Ustaw czas ekspozycji na automatyczny, średni binning, 2 - 3 dla przysłony i filtr wzbudzenia na 745 nm oraz filtry emisji na 780 nm do 840 nm.
- Aby skonfigurować sekwencję, kliknij Konfiguracja sekwencji i wybierz 9 - 12 punktów trans-illumination w obszarze płuc.
- Kliknij Pobierz, aby uzyskać obraz.
- Umieść mysz z powrotem w klatce po obrazowaniu.
- Monitoruj myszy aż do całkowitego wyzdrowienia lub poświęć je w celu ilościowego określenia CFU, jeśli obrazowanie odbywa się w punkcie czasowym eksperymentu. Wykonaj zmodyfikowaną punktację Karnofsky'ego, aby monitorować dobrostan myszy po obrazowaniu.
