$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przejście kultur organoidowych
- Dodaj 1 ml zimnego podłoża podstawowego do matrycy podstawowej w studzience. Za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml energicznie pipetuj w górę i w dół, aż matryca podstawowa zostanie rozbita. Przenieść do probówki o pojemności 15 ml. Ułóż na lodzie.
- Weź organoidy z pipety i energicznie pipetuj 10 razy w górę iw dół. Rozpad organoidów można zaobserwować gołym okiem.
2. Mikroiniekcja hodowli organoidów.
Uwaga: Ten protokół może być używany do mikrowstrzykiwania bakterii do organoidów. Pomocne może być rozpoczęcie iniekcji od organoidów, które są bardziej podatne na mikroiniekcje. Na przykład organoidy żołądka myszy mogą wyrosnąć na bardzo duże organoidy torbielowate, które są łatwe do namierzenia.
- Przygotowanie materiału
- Pobrać szklaną kapilę do dwóch igieł iniekcyjnych za pomocą ściągacza do mikropipet, zgodnie z zaleceniami producenta. Ściągacz do mikropipet podgrzeje szklaną kapilarnę w środku i rozciągnie kapilarnę na dwie części, tworząc w ten sposób dwie szklane igły. Praktyczne jest wyciągnięcie kilku igieł i przechowywanie ich na czystej szalce Petriego.
- Aby umożliwić infekcję bakteryjną, usuń antybiotyki ze wszystkich pożywek na co najmniej 3 zmiany pożywki (= jeden tydzień). Spowoduje to rozcieńczenie antybiotyków z matrycy podstawy. Jeśli używasz szczepu bakteryjnego, który jest oporny na określony antybiotyk, dodaj ten konkretny antybiotyk, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia.
- Przygotuj stół warsztatowy do mikroiniekcji. W przypadku pracy na różnych poziomach bezpieczeństwa biologicznego może być konieczne umieszczenie mikroskopu stereoskopowego w sterylnej ławce. W tym protokole należy wstrzyknąć H. pylori w warunkach bezpieczeństwa biologicznego 2 pod mikroskopem stereoskopowym w sterylnej ławce.
- Hoduj bakterie zgodnie ze standardowymi protokołami.
- Aby oszacować liczbę infekcji (MOI), oszacuj dwa parametry: liczbę bakterii i liczbę komórek w organoidzie, jak opisano poniżej. MOI może korelować z wynikami, na przykład z ekspresją mRNA IL-8 gospodarza.
- Aby obliczyć gęstość bakterii w roztworze infekcji, najpierw ustal standardową krzywą gęstości optycznej i jednostek tworzących kolonie (CFU) zgodnie ze standardowymi protokołami. Gęstość optyczna 0,1 przy 550 nm powinna dawać około 10-7 jtk/ml.
- Aby oszacować liczbę komórek na organoid, policz liczbę organoidów w 1 dołku. Rozbić organoidy zgodnie z opisem w krokach 1.1-1.4. Po odwirowaniu przez 5 minut w sile 200 g i temperaturze 4 °C, dodać 1 ml enzymatycznego roztworu dysocjacyjnego i zawiesić.
- Inkubować w temperaturze 37 °C z wielokrotnym wytrząsaniem przez 5-10 minut. Określić, czy komórki dysocjowały na pojedyncze komórki pod mikroskopem (mikroskop odwrócony, taki jak Leica DMIL przy 10-krotnym powiększeniu). W razie potrzeby przedłużyć inkubację.
- Policz komórki na organoid za pomocą hemocytometru i oblicz liczbę komórek na organoid. Ludzkie organoidy żołądkowe o średnicy około 200 μm mają około 4 000 komórek. Wstrzyknięcie 0,2 μl roztworu bakteryjnego z 1 x 109 bakterii na ml daje przybliżony MOI wynoszący 50.
- Wstrzykiwanie organoidów.
Uwaga: W przypadku mikroiniekcji szklana igła jest stabilizowana w uchwycie, którym można manewrować w 3 wymiarach za pomocą mikromanipulatora. Organoidy pozostają w macierzy piwnicznej w studni. Ze względu na rozmiar i umiejscowienie w studni nie wszystkie organoidy są jednakowo podatne na wstrzykiwanie. Zazwyczaj 30 największych organoidów w jednym dołku można namierzyć w ciągu 5 minut.
- Zbierz bakterie i umyj je w pożywce podstawowej zgodnie ze standardowymi protokołami.
- Obliczyć liczbę bakterii w ml zgodnie z gęstością optyczną (patrz krok 2.1.5.1). Rozcieńczyć bakterie do 1 x 109 bakterii na ml w podłożu podstawowym.
- Weź szklaną igłę. Za pomocą kleszczy rozbij końcówkę tak, aby otwór miał szerokość około 10 μm.
- Włożyć igłę do uchwytu do wstrzykiwań i przymocować ją do mikromanipulatora.
- Pobrać około 10 μl roztworu bakteryjnego do igły.
- Umieścić 4-dołkową płytkę z niskimi krawędziami zawierającą kultury organoidów pod mikroskopem stereoskopowym.
- Poruszając się za pomocą mikromanipulatora, wyceluj igłą w pojedynczy organoid. Umieść igłę blisko organoidu, a następnie włóż igłę do organoidu jednym szybkim ruchem. Wstrzyknąć około 0,2 μl roztworu bakteryjnego do każdego organoidu za pomocą mikroiniektora.
3. Zbieraj organoidy do dowolnej analizy.
- Na przykład, utrwalić organoidy po 4 godzinach. Usunąć supernatant i dodać 1 ml 2% formaldehydu i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej lub O/N w temperaturze 4 °C. Organoidy można przetwarzać do celów immunohistochemicznych zgodnie ze standardowymi procedurami.