1. Generowanie biblioteki białek zielonej fluorescencji, mutantów transpozonów Coxiella oznaczonych GFP
Manipuluj Coxiella burnetii RSA439 NMII w zabezpieczeniu biologicznym poziomu 2 (BSL-2) w komorze bezpieczeństwa mikrobiologicznego (MSC) zgodnie z lokalnymi zasadami. Jeśli jest to zgodne z zastosowanym modelem bakteryjnym, powtórz kroki od 1.4.1 do 1.4.4, aby zwiększyć prawdopodobieństwo uzyskania mutantów klonalnych. Typowa biblioteka mutantów składa się (co najmniej) z liczby mutantów równej trzykrotności liczby sekwencji kodujących zapisanych w genomie użytego organizmu.
- Przygotowanie elektrokompetentnego Coxiella RSA439 NMII:
- Przygotuj 1x zakwaszony cytrynian cysteina pożywka-2 (ACCM-2): 13,4 mM kwas cytrynowy, 16,1 mM cytrynian sodu, 3,67 mM fosforan potasu, 1 mM chlorek magnezu, 0,02 mM chlorek wapnia, 0,01 mM siarczan żelaza, 125,4 mM chlorek sodu, 1,5 mM L-cysteina, 0,1 g/L Bacto Neopepton, 2,5 g/L casaminokwasy, 1 g/L beta-cyklodekstryna metylowa, 125 ml/L Roswell Park Memorial Institute (RPMI). Dostosuj pH do 4,75 i sterylizuj filtrem (nie sterylizuj w autoklawie).
nuta: Ciecz ACCM-2 jest stabilna w temperaturze 4 °C przez około 1 miesiąc.
- Zaszczepić 100 ml ACCM-2 2 ekwiwalentem genomu (GE)/ml Coxiella RSA439 NMII (z materiału podstawowego bakterii uprzednio wygenerowanego i oznaczonego ilościowo jak w kroku 1.5) z zapasów o temperaturze -80 °C i rozprowadzić zawiesinę bakteryjną w kolbach do hodowli komórkowych o długości 75cm2 z wentylowanymi nasadkami (10 - 15 ml zawiesiny bakteryjnej na kolbę). Rośnie przez 7 dni w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze składającej się z 5% dwutlenku węgla (CO2 ) i 2,5% tlenu (O2 ).
- Otrzymaną zawiesinę bakteryjną zebrać w probówkach o pojemności 50 ml i odwirować przy 3 900 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
- Odrzucić sklarat i ponownie zawiesić osad w 30 ml 10% glicerolu. Wirować przy 3 900 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
- Zawiesić osad w odpowiedniej objętości 10% glicerolu (zwykle 2 ml) i poddzielić 50 μl w probówkach o objętości 500 μl. Utrzymuj zawieszone bakterie na lodzie podczas całego procesu.
nuta: Na tym etapie bakterie są elektrokompetentne i jedna porcja wystarcza do wykonania jednej elektroporacji. Zawiesiny bakteryjne mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez 6 miesięcy lub mogą być bezpośrednio wykorzystane do elektroporacji plazmidowego kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA).
- Elektroporacja kompetentnej Coxielli za pomocą plazmidów kodujących transpozony i transpozazy:
- Wstępnie schłodzić kuwetę do elektroporacji o średnicy 0,1 cm przez 10 minut na lodzie. Zmieszać 50 μl elektrokompetentnej Coxielli z 10 μg plazmidu transpozonu i 10 μg plazmidu transpozazy. Upewnij się, że stężenie plazmidu jest wyższe niż 500 μg/ml, aby zminimalizować rozcieńczenie glicerolu.
- Elektroporować przy użyciu następującej konfiguracji: 18 kV, 500 Ω, 25 μF. Upewnij się, że wynikowa stała czasowa mieści się w zakresie od 9 do 13 ms.
- Natychmiast dodaj 950 μl RPMI, ponownie zawieś elektroporowane bakterie i przenieś do rurki z nakrętką i utrzymuj w temperaturze pokojowej.
- Weź 200 μl elektroporowanych bakterii i dodaj 3 ml ACCM-2 uzupełnionego 1% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS) do 6-dołkowych płytek. Dodać 88 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) do pozostałej objętości bakterii poddanych elektroporacji (aby osiągnąć końcowe stężenie 10% DMSO) i przechowywać w temperaturze -80 °C.
UWAGA: dla poniższego protokołu element transpozycyjny i transpozaza są kodowane przez dwa różne plazmidy (odpowiednio pITR-CAT-GFP i pUC19-Himar1C9). Oba plazmidy nie mają specyficznego dla Coxielli pochodzenia replikacyjnego, co czyni je plazmidami samobójczymi po elektroporacji w Coxiella. Zapewnia to stabilne insercje transpozonów. Element transpozycyjny zawiera kasetę oporności na chloramfenikol pod regulacją promotora Coxiella p1169 do selekcji oraz genu gfp pod regulacją promotora Coxiella p311 w celu znakowania wygenerowanych mutantów GFP.
- Wybór mutantów transpozonów:
- Inkubować 6-dołkowe płytki zaszczepione w sposób opisany powyżej (1.2.4) przez noc w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 i 2,5 %O2. Dodać odpowiednie antybiotyki (375 μg/ml kanamycyny lub 3 μg/ml chloramfenikolu). Inkubuj kulturę bakteryjną przez dodatkowe 3 dni w warunkach opisanych powyżej.
- Izolacja poszczególnych mutantów:
- Przygotowanie stałych płytek ACCM-2 i posiew mutantów transpozonu Coxiella
nuta: Poniższe instrukcje dotyczą 1 szalki Petriego, należy przetestować kilka rozcieńczeń kultur bakteryjnych w celu oceny optymalnej objętości inokulacji do izolacji kolonii.
- Podgrzej 10,5 ml 0,5% agarozy w kuchence mikrofalowej i pozwól jej ostygnąć w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C. Podgrzać 11,25 ml 2x ACCM-2 (pH 4,75) w temperaturze 37 °C.
- Przygotuj agarozę dolną:
- Wymieszaj 10 ml stopionej 0,5% agarozy z 10 ml 2x ACCM-2 i dodaj odpowiednie antybiotyki (375 μg/ml kanamycyny lub 3 μg/ml chloramfenikolu).
- Wlej natychmiast na szalkę Petriego. Trzymaj szalkę Petriego bez pokrywki, pozwól podłożu ostygnąć przez 30 minut i wysusz na powietrzu przez 20 minut.
- Przygotuj górną agarozę:
- Zmieszać 1,25 ml 2x ACCM-2 z 0,75 ml wody w probówce z polistyrenu o pojemności 5 ml, dodać odpowiednie antybiotyki (375 μg/ml kanamycyny lub 3 μg/ml chloramfenikolu) i inkubować w temperaturze 37 °C.
- Dodać kulturę bakteryjną (zwykle od 1 do 100 μl) i wirować przez 5 sekund.
- Dodaj 0,5 ml roztopionej agarozy, wymieszaj i natychmiast wylej na spód agarozy.
- Pozostawić do ostygnięcia na 20 minut, założyć pokrywkę na szalkę Petriego i inkubować w temperaturze 4 °C przez 20 minut, aby ułatwić krzepnięcie agarozy.
- Suszyć na powietrzu przez 20 minut bez pokrywki w MSC. Hoduj płytki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 i 2,5% O2 przez 6 do 7 dni.
- Dodać DMSO do pozostałych kultur bakteryjnych w celu osiągnięcia końcowego stężenia 10% DMSO i przechowywać w temperaturze -80 °C.
- Ocenić optymalne rozcieńczenie w następujący sposób: upewnić się, że kolonie mają średnicę od 0,5 do 1 mm i są odpowiednio odizolowane, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Rozmrozić pozostałe kultury bakterii z ppkt 1.4.2 i rozszczepić na agarze ACCM-2 w odpowiednim rozcieńczeniu, jak opisano w ppkt 1.4.1.2 i 1.4.1.3. Inkubować przez 6 do 7 dni, jak opisano w 1.4.1.3.5.
- Gdy kolonie są wykrywalne, należy je zebrać, odcinając koniec końcówki o pojemności 1 ml, wybierając zatyczkę zawierającą izolowane kolonie i rozpraszając kolonię, pipetując 1,5 ml ACCM-2 zawierającego odpowiednie antybiotyki (375 μg/ml kanamycyny lub 3 μg/ml chloramfenikolu) w 24-dołkowej płytce. Amplifikować poszczególne kolonie przez 6 dni w warunkach opisanych w ppkt 1.3.1. W 3 dniu inkubacji rozproszyć grudki bakterii, pipetując każdą kulturę.
- Każdą zmutowaną zawiesinę należy przechowywać w probówkach z nakrętkami 2D z kodami kreskowymi w 96-dołkowych płytkach w 10% DMSO w temperaturze -80 °C.
- Ocena stężenia bakterii:
nuta: Poniższy protokół może być zastosowany w celu uzyskania krzywych wzrostu mutantów bakteryjnych replikujących się w podłożu aksenicznym (patrz 1.4.4).
- Przygotowanie krzywej standardowej:
- Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 2 μg/ml dwuniciowego DNA (dsDNA) (zazwyczaj losowy plazmid o znanej wielkości i stężeniu) w 1x kwas tris-etylenodiaminotetraoctowy, EDTA (TE). Przygotować 10-krotne seryjne rozcieńczenia z roztworu podstawowego, aby uzyskać stężenia w zakresie od 2 μg/ml do 2 ng/ml. Dozować 50 μl każdego stężenia do pojedynczych studzienek 96-dołkowej mikropłytki z czarnymi ściankami i dnem (patrz Tabela Materiały).
- Rozcieńczyć odczynnik do oznaczania ilościowego dsDNA w stosunku 1:200 w 1x buforze TE i dodać 55 μl rozcieńczonego odczynnika do każdej próbki na 96-dołkowej mikropłytce. Dobrze wymieszać za pomocą wytrząsarki do płytek i inkubować przez 2 do 5 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności.
- Zmierz fluorescencję próbek za pomocą czytnika mikropłytek fluorescencyjnych i filtrów dla standardowych długości fal fluoresceiny (wzbudzenie ~480 nm, emisja ~520 nm).
- Wykreślić zakres stężenia plazmidu w stosunku do odczytów intensywności fluorescencji.
- Oznaczanie ilościowe zawiesiny bakteryjnej:
- Dozować 5 μl 10% Triton X-100 na dołek do 96-dołkowej mikropłytki z czarnymi ściankami i dnem (patrz Tabela materiałów). Dodać 50 μl zawiesin bakteryjnych do każdej studzienki i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce płytkowej.
- Rozcieńczyć odczynnik do oznaczania ilościowego dsDNA w stosunku 1:200 w 1x buforze TE i dodać 55 μl rozcieńczonego odczynnika do każdej próbki na 96-dołkowej mikropłytce. Dobrze wymieszać za pomocą wytrząsarki do płytek i inkubować przez 2 do 5 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności.
- Zmierz fluorescencję próbek za pomocą czytnika mikropłytek fluorescencyjnych i filtrów dla standardowych długości fal fluoresceiny (wzbudzenie ~480 nm, emisja ~520 nm).
- Aby uzyskać stężenie DNA bakterii, należy wykreślić odczyty fluorescencji na wykresie otrzymanym w pkt 1.5.1.4. Podziel stężenie DNA przez masę genomu Coxiella (2,2 fg), aby uzyskać stężenia bakterii. Wyrażanie wyników w ekwiwalencie genomu/ml.
- Odrzucaj mutanty wykazujące znaczny defekt wzrostu ACCM-2.
2. Reakcja łańcuchowa polimerazy kolonii pojedynczego startera (PCR), sekwencjonowanie i adnotacja
UWAGA: Poniższy protokół dotyczy amplifikacji DNA 96 próbek, do kolejnych kroków zalecana jest pipeta wielokanałowa. Oczyszczanie kolumnowe produktów PCR za pomocą kulek magnetycznych i sekwencjonowanie DNA za pomocą startera specyficznego dla transpozonów (2.3) jest zlecane firmie zewnętrznej.
- Upewnij się, że starter amplifikacyjny jest zaprojektowany tak, aby hybrydyzować od 100 do 200 par zasad przed odwróconym powtórzeniem tandemowym (ITR), w celu uzyskania produktów PCR pokrywających miejsce insercji transpozonu w genomie Coxiella. Przygotować 3 ml mieszanki PCR (1x bufor o wysokiej wierności, 200 μM trifosforanu deoksynukleozydu (dNTP), 1 μM starter do amplifikacji, 20 U/ml polimerazy DNA o wysokiej wierności) i dozować 29 μl na basenik do 96-dołkowej płytki PCR ustawionej na lodzie. Przenieść 1 μl każdego mutanta w fazie stacjonarnej w ACCM-2 do mieszaniny PCR.
- Uruchom PCR ze wstępną denaturacją (98 °C, 1 min), 20 cyklami o wysokiej rygorystyczności (98 °C, 10 sekund; 50 °C, 30 sekund; 72 °C, 90 sekund), 30 cyklami o niskiej rygorystyczności (98 °C, 10 sekund; 30 °C, 30 sekund; 72 °C, 90 sekund) i 30 cyklami o wysokiej rygorystyczności (98 °C, 10 sekund; 50 °C, 30 sekund; 72 °C, 90 sek.), a następnie końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 7 min.
- Oczyść produkty PCR za pomocą kulek magnetycznych i sekwencjonuj DNA za pomocą startera specyficznego dla transpozonów. Zaprojektuj starter specyficzny dla transpozonu o przewidywanej temperaturze topnienia obejmującej od 50 °C do 75 °C, zawartości GC między 40 % a 60 %, długości od 18 do 25 nukleotydów oraz miejscu wyżarzania za miejscem hybrydyzacji startera amplifikacji i co najmniej 100 par zasad przed pierwszą parą zasad transpozonu ITR.
- Korzystając z oprogramowania do analizy sekwencji, załaduj kompletny, opisany genom Coxiella burnetii 493 NMI. Użyj funkcji "wyrównaj do odniesienia", aby załadować i wyrównać (wystrzelić) wyniki sekwencjonowania oraz określić miejsce transpozycji. Odrzuć mutanty z niepasującymi i/lub wyświetlającymi podwójne odczyty. Aby monitorować nasycenie biblioteki mutantów, należy prowadzić rejestr występowania wielu insercji transpozonów w tym samym miejscu.
3. Wyzwanie dla komórek eukariotycznych z mutantami Coxiella i monitorowanie wzrostu wewnątrzkomórkowego
UWAGA: Do następujących kroków zalecana jest pipeta wielokanałowa. Zakażenia przeprowadzono w trzech egzemplarzach na sterylnych 96-dołkowych mikropłytkach o czarnych ściankach i płaskim przezroczystym dnie. wt Coxiella burnetii wykazująca ekspresję GFP została dostarczona przez dr Roberta Heinzena.
- Hoduj komórki Vero w RPMI bez czerwieni fenolowej uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) przy braku antybiotyków (Complete RPMI pożywka).
- Dzień przed zakażeniem przemyć komórki Vero z kolby do hodowli komórek zlewających się lub subzlewających się 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
- Odłączyć komórki Vero przez dodanie 1 ml roztworu trypsyny EDTA do kolby hodowli komórkowej i inkubować przez 3-5 minut w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 .
- Ponownie zawiesić komórki w 10 ml kompletnego podłoża RPMI. Policz komórki i przygotuj zawiesinę komórek w ilości 105 komórek na ml.
- Dozować 100 μl zawiesiny komórek do każdego dołka czarnej 96-dołkowej płytki z płaskim przezroczystym dnem.
- Wirować przez 5 minut przy 400 x g w temperaturze pokojowej (RT) w celu ułatwienia przylegania komórek do dna studzienek i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 .
- Rozmrozić 96-dołkowe płytki zawierające mutanty Coxiella w temperaturze pokojowej i rozcieńczyć 150 μl zawiesiny bakteryjnej w 300 μl RPMI bez czerwieni fenolowej i FBS w głębokiej płytce 96-dołkowej.
- Usunąć pożywkę z mikropłytki zawierającej komórki Vero i dozować 100 μl/basenik rozcieńczonych mutantów Coxiella (MOI 100). Użyć studzienki A1 jako kontroli ujemnej (niezakażone) oraz studzienek A2 i A3 jako kontroli pozytywnej (komórki zakażone wt Coxiella wykazujące ekspresję GFP przy wielokrotności zakażeń (MOI) 100 i 200).
- Odwirowywać płytkę przez 10 minut przy 400 x g w temperaturze pokojowej za pomocą aerozolowego uchwytu na płytkę wirówkową.
- Inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 przez 2 godziny, a następnie zastąpić pożywkę zawierającą bakterie 100 μl/studzienkę świeżej, kompletnej pożywki RPMI.
- Mierz fluorescencję GFP codziennie przez 7 dni za pomocą czytnika mikropłytek fluorescencyjnych i filtrów dla standardowych długości fal fluoresceiny (wzbudzenie ~480 nm, emisja ~520 nm). Aby uniknąć zakłóceń spowodowanych kondensacją i dyspersją sygnału w pożywce hodowlanej, należy użyć dolnego wzbudzenia i zapisu emisji na czytniku mikropłytek.
4. Przygotowanie próbek do automatycznego pozyskiwania obrazów
UWAGA: Procedura dotyczy jednej płytki 96-dołkowej, odpowiednio zwiększaj objętość. Kroki z 4.2 mogą korzystać z podkładki do płyt.
- W 7 dniu po zakażeniu należy usunąć pożywkę z płytki i zastąpić ją 50 μl/dołek świeżej, kompletnej pożywki zawierającej przepuszczalny dla komórek barwnik fluorescencyjny w odpowiednim rozcieńczeniu (zwykle 1:1000, w celu optymalizacji w zależności od użytej linii komórkowej). Inkubować komórki przez 30–60 minut w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5%CO2.
- Zastąp pożywkę 50 μl/basenik 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS, inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT), a następnie usuń bufor zawierający PFA i przemyj 3 razy PBS.
- Usunąć PBS i dozować 50 μl/studzienkę roztworu blokującego (0,5% albuminy surowicy bydlęcej, 50 mM chlorku amonu, NH4Cl w PBS, pH 7,4) uzupełnionego 0,05% saponiną. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
- Zastąp roztwór blokujący 40 μl/basenik świeżym roztworem blokującym uzupełnionym saponiną (jak wyżej) i przeciwciałem przeciwko glikoproteinie błonowej-1 związanej z antylizosomami (anty-LAMP1) w rozcieńczeniu 1:500. Inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Usunąć roztwór blokujący i przemyć 96-dołkową płytkę 5 razy 100 μl/basenik PBS.
- Dozować 40 μl/basenik roztworu blokującego uzupełnionego saponiną (jak wyżej), odpowiednim fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym (w rozcieńczeniu 1:1,000) w celu ujawnienia przeciwciała anty-LAMP1 zastosowanego w kroku 4.4 i z Hoechst 33258 w ilości 5 μg/ml. Inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Usunąć roztwór blokujący i przemyć 96-dołkową płytkę 5 razy 100 μl/basenik PBS. Pozostawić objętość PBS odpowiadającą ostatniemu przemyciu na płytce 96-dołkowej, ponieważ utrwalone komórki nie powinny wyschnąć.
- Natychmiast należy pobrać obraz płytki lub przechowywać ją w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem, do późniejszej analizy.
5. Akwizycja obrazu
- Uzyskuj obrazy w kanałach GFP (488 nm, bakterie), Hoechst 33258 (350 nm, jądra komórek gospodarza), czerwonych (~555 nm, marker błony komórkowej) i dalekiej czerwieni (~615 nm, LAMP1) za pomocą automatycznego mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw 20X. Zdobądź 21 niezależnych pól na studzienkę, aby zobrazować co najmniej 5 000 komórek na próbkę. Zastosuj autofokus, używając kanału jąder komórek gospodarza jako odniesienia. Podczas pracy z patogenami bakteryjnymi infekującymi niewielki odsetek komórek gospodarza, użytkownicy mogą dostosować liczbę niezależnych pól obrazowanych na studzienkę, aby uzyskać co najmniej 500 zainfekowanych komórek do analizy.
