Następujące protokoły opiszą metody hodowli i badania inwazji gatunku beztlenowego, P. gingivalis; jednak te protokoły mogą być stosowane dla wielu patogenów beztlenowych. Chociaż stosowane są HUVEC, protokół ten może być stosowany w przypadku innych komórek eukariotycznych, zarówno immunologicznych, jak i nieimmunologicznych.
1. Użytkowanie i konserwacja komory beztlenowej
Uwaga: P. gingivalis jest beztlenowcem wrażliwym na normalne poziomy tlenu spotykane w otaczającym powietrzu. Kontrolowane środowisko beztlenowe ma zasadnicze znaczenie dla uprawy P. gingivalis.
- W tym miejscu należy utrzymywać sztuczną atmosferę oznaczoną jako mieszanina gazów beztlenowych (80% N2, 10% H2, 10% CO2 ) w komorze anaerobowej winylu (rysunek 1A). Użyj śluzy powietrznej (rysunek 1B) do przenoszenia przedmiotów ze środowiska laboratoryjnego do komory beztlenowej. Śluza powietrzna działa ręcznie, dwukrotnie przedmuchując ją gazemN2 przed wprowadzeniem zmieszanego gazu beztlenowego.
- Użyj kolumny do usuwania siarkowodoru (rysunek 1C) do bezobsługowego usuwania niepożądanego siarkowodoru. Umieść osuszacz w komorze, aby usunąćH2Owytworzony przez katalizator i uniknąć aerozoli, które ułatwiają rozprzestrzenianie się zanieczyszczeń.
nuta: Siarkowodór jest naturalnym produktem ubocznym metabolizmu wielu bakterii beztlenowych, a jego nagromadzenie jest toksyczne dla bakterii i może spowodować uszkodzenie elektroniki i skrócenie żywotności katalizatora.
- Użyj skrzynki wentylatora, aby wprowadzić cyrkulację atmosfery komory przez katalizator palladowy, który usuwa tlen w obecności wodoru (rysunek 1D).
Uwaga: Recyrkulacyjny filtr atmosferyczny (wysokowydajny filtr cząstek stałych lub HEPA) usuwa zanieczyszczenia unoszące się w powietrzu o wielkości 0,22 μm lub większej.
- Hodowla bakterii beztlenowych w inkubatorze o temperaturze 37 °C, który znajduje się wewnątrz komory beztlenowej. Podczas pracy w komorze beztlenowej należy stosować standardowe techniki aseptyki.
2. Przygotowanie bakterii beztlenowych
Uwaga: P. gingivalis jest aerotolerancyjny i może być przechowywany w warunkach tlenowych, ale nie będzie rósł w obecności tlenu na poziomie wyższym niż 6%. Komora beztlenowa jest niezbędna do prawidłowej hodowli P. gingivalis i innych gatunków beztlenowych (ryc. 1). Przed rozpoczęciem pracy z mikrobeztlenowcami wymagane jest odpowiednie przeszkolenie i edukacja w zakresie użytkowania komór beztlenowych.
- Równoważyć wszystkie ciekłe podłoża i płytki do warunków beztlenowych przez co najmniej 12 godzin przed eksperymentem w celu usunięcia pozostałości tlenu.
- Przenieść P. gingivalis z zamrażarki o temperaturze -80 °C do komory beztlenowej i pozostawić do rozmrożenia.
- Smuga P. gingivalis na płytkach agarowych z krwią sojową tryptykazy (TSA II z 5% krwią owczą). Owinąć płytki w parafolię i przechowywać w temperaturze 37 °C w inkubatorze beztlenowym przez 4-7 dni.
- Zaszczepić P. gingivalis w 3 ml bulionu do naparu z serca (BHI) uzupełnionego heminą i menadionem, wzbogaconą nieselektywną płynną pożywką do izolacji i hodowli mikroorganizmów beztlenowych i wybrednych, używając sterylnych pętli.
nuta: W celu długotrwałego przechowywania należy wymieszać kultury bakterii przygotowane w BHI z glicerolem lub DMSO (10-20% stężenie końcowe) i umieścić w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
- Przygotuj kulturę starterową P. gingivalis, rozcieńczając ją w stosunku 1:10 i pozwalając bakteriom rosnąć do środkowej fazy logarytmicznej.
Uwaga: Gęstość optyczna zawiesiny bakteryjnej jest określana, a stężenie bakterii dla każdego szczepu, który ma być badany, jest dostosowywane. Dla P. gingivalis zawiesina o średnicy zewnętrznej660 wynosząca 0,7 odpowiada środkowej fazie logarytmicznej i ~7 x 108 komórek/ml. Warunki wzrostu opisane w powyższym protokole są specyficzne dla P. gingivalis i mogą wymagać dostosowania do innych szczepów bakterii.
3. Hodowla komórek śródbłonka
Uwaga: Kup zbiorcze pierwotne HUVEC i hodowlę w podstawowym podłożu zawierającym czynniki wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) w temperaturze 37 °C w 5% CO2 zgodnie z instrukcjami producenta.
- HUVEC nasienny w kolbach T-75 o wymiarach 2,5 x 105 komórek/kolbę w 15 ml pożywki VEGF.
nuta: Sprawdzić żywotność za pomocą rozcieńczenia 1:1 z 4,0% błękitem trypanowym. Komórki z naruszoną błoną zachowają błękit trypanowy, a zdrowe komórki z nienaruszonymi błonami będą wyglądały na białe, gdy będą oglądane pod mikroskopem światła lornetki. Policz 100 komórek i upewnij się, że ponad 80% komórek jest zdolnych do życia.
- Wymieniaj pożywkę co 2 dni na wstępnie podgrzaną świeżą pożywkę VEGF, aż komórki osiągną ~80% konfluencji.
- Umyj komórki raz wstępnie podgrzaną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Uwolnić komórki z kolby T75 przez inkubację z 2 ml trypsyny-EDTA (0,25%) przez 5 minut, a następnie 2 ml roztworu neutralizującego trypsynę.
- Zebrać zawieszone HUVEC w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Wypłukać wszelkie dodatkowe komórki z kolb T-75 za pomocą PBS i przenieść do stożkowych probówek o pojemności 50 ml.
- Odwirować komórki przy 200 x g przez 10 min.
- Usunąć supernatant i zawiesić osad komórkowy w 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki VEGF.
- Określ stężenie komórek za pomocą hemocytometru lub podobnego urządzenia do liczenia komórek.
- Oblicz ilość zawiesiny komórek, którą należy dodać do płytki 6-dołkowej (400 000/dołek) lub 12-dołkowej płytki ze szkiełkami nakrywkowymi (50 000/dołek). HUVEC będą gotowe do eksperymentów następnego dnia.
4. Test przetrwania Inwazja/Interakcja (Poszycie)
Uwaga: Podczas wykonywania tego testu, przygotuj dwie 6-dołkowe płytki komórek śródbłonka wysianych na 400 000 komórek/studzienkę. Jedna płytka zostanie wykorzystana do oceny bakterii przyczepionych i zinternalizowanych przez komórki gospodarza. Druga płytka będzie uwzględniać bakterie wewnątrzkomórkowe. Płytka 6-dołkowa pozwala na wykonanie trzech próbek dwóch próbek w jednym doświadczeniu. Aby zapoznać się z zarysem tego protokołu, zapoznaj się ze schematem blokowym testu przeżycia (ryc. 2).
- Przygotować bakterie beztlenowe zgodnie z powyższym opisem (patrz sekcja 1), aż osiągną średni log wzrostu (OD660 0,5-0,7).
- Odwirować bakterie przy 5 000 x g przez 10 min.
Uwaga: Jeśli wirówka znajduje się poza komorą beztlenową, próbki bakterii należy przenosić w szczelnie zamkniętej probówce o pojemności 15 ml i owinąć nasadkę parafilmem, aby zapobiec wyciekowi tlenu.
- Umieścić granulowany P. gingivalis z powrotem w komorze i odrzucić supernatant. Przemyć PBS i ponownie granulować bakterie przed ponownym wymieszaniem w pożywce VEGF. Przygotować zawiesiny dla wszystkich szczepów bakterii, które mają być badane przy OD660 0,7, co odpowiada środkowej fazie logarytmicznej (~7 x 10,8 komórek/ml). Bakterie są teraz gotowe do infekcji.
- Przenieść 6-dołkowe płytki zawierające HUVEC z inkubatora do hodowli tkankowych do komory beztlenowej. Usuń podłoże i przemyj je trzykrotnie anaerobowym PBS. Dodać 2 ml beztlenowej pożywki VEGF do każdej studzienki i umieścić płytki w temperaturze 37 °C w inkubatorze beztlenowym na 20 minut, aby wyrównać temperaturę infekcji.
nuta: Bakterie na płytkach z agarem z krwią w celu zapewnienia, że te używane do infekcji są jednorodne i nie są zanieczyszczone po zakażeniu.
- Infekuj komórki gospodarza bakteriami przy wielokrotności infekcji (bakterie MOI: gospodarz) 100:1,
nuta: Liczba komórek HUVEC jest określana poprzez wykonanie testu wykluczenia trypana na jednym dołku przed zakażeniem. Liczbę komórek bakteryjnych określa się za pomocą gęstości optycznej (np. OD 0,5 = 5 x 108 komórek/ml). Stężenie bakterii jest dostosowywane do prawidłowego MOI na podstawie stężenia HUVEC.
- Umieścić 6-dołkowe płytki z zakażonymi HUVEC w inkubatorze beztlenowym i pozwolić bakteriom na interakcję z komórkami gospodarza przez 30 minut.
- Przygotuj saponinę w BHI (1,0% w/v) w komorze beztlenowej i przefiltruj przez filtr 0,2 μm.
- Przetrwanie zarówno bakterii przyczepionych, jak i zinternalizowanych.
- Wyjąć płytki z inkubatora, odessać pożywkę, przemyć trzykrotnie beztlenowym PBS i dodać 2 ml przefiltrowanej 1,0% saponiny (przygotowanej zgodnie z opisem w kroku 4.8). Inkubować przez 15 minut, aby umożliwić lizę komórek gospodarza.
- Zeskrob dno każdej studzienki za pomocą skrobaka do komórek. Zebrać mieszaninę komórek z każdej studzienki i rozcieńczyć w stosunku 1:1 w BHI.
- Przystąpić do seryjnego rozcieńczania próbki. W zależności od gatunku i stężenia bakterii należy dostosować seryjne rozcieńczenia. Zacznij od rozcieńczeń 1:100 lub 1:1,000.
- Umieścić 200 μl pożądanego rozcieńczenia na płytkach z agarem z krwią. Owinąć płytki w parafilm i umieścić je w inkubatorze beztlenowym w temperaturze 37 °C.
- Po siedmiu dniach inkubacji w temperaturze 37 °C usunąć płytki i policzyć jednostki tworzące kolonie (CFU) za pomocą lightboxa do ręcznego liczenia kolonii.
nuta: Jednostki CFU są wyliczone. W przypadku większych ilości jtk można wykonać zdjęcia i użyć oprogramowania komputerowego w celu ułatwienia wyliczenia jtk.
